王宇彤 沈義媛* 霍相羽 牛 慧 韓思雨 童津津** 熊本海 蔣林樹**

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛乳是由乳腺產(chǎn)生的一種具有膠體特性的生物學(xué)液體，成分包括脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、礦物質(zhì)、維生素和水[1]。其中乳蛋白是牛乳的重要營養(yǎng)成分，因此在奶牛乳產(chǎn)業(yè)中，提高牛乳中乳蛋白含量被越來越多的研究者所關(guān)注。目前，奶牛養(yǎng)殖場可以通過改善飼糧營養(yǎng)水平、加強(qiáng)管理、提高遺傳育種技術(shù)等方面提高牛乳中乳蛋白的含量[2]。植物提取物來源于天然植物，因其具有低毒性、低殘留、綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性等特征，逐漸成為畜禽飼料行業(yè)的研究熱點(diǎn)并取得了一定的研究進(jìn)展[3-4]。竹葉中提取的竹葉黃酮(bamboo leaf flavonoids,BLF)，因其天然活性成分在機(jī)體內(nèi)殘留少、不產(chǎn)生耐藥性，并且具有抗炎、抗氧化、提高機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)功能，在畜禽生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用潛能[5]。

現(xiàn)有研究表明，竹葉中含有的化學(xué)成分包括黃酮、苷類、活性多糖類、特種氨基酸、肽類、芳香成分以及錳、鋅、硒等多種對人體有益的微量元素[6-8]。其中，BLF是從竹葉中提取出的一種活性物質(zhì)，可作為一種健康無毒害的飼料添加劑，并被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)認(rèn)定為天然食品添加劑。據(jù)報(bào)道，BLF具有清除氧自由基和增強(qiáng)免疫力的功能，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多種生物活性[5,9-16]。本團(tuán)隊(duì)前期研究[17]結(jié)果表明，飼糧中添加0、30.0、60.0和90.0 g/d的竹葉提取物(BLF含量為40%)飼喂奶?？娠@著提高乳汁中乳糖和乳蛋白的含量，其中30.0 g/d組奶牛血清中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)含量顯著增加，以及竹葉提取物可顯著提高奶牛血漿中過氧化氫酶(CAT)活性，顯著降低血漿中丙二醛(MDA)含量。侯昆等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛全混合日糧(TMR)中添加BLF(黃酮含量為40%)與青蒿提取物(青蒿素含量為39%)，可以在一定程度上提高奶牛的產(chǎn)奶量，顯著提高乳蛋白率并且降低奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)。上述研究表明，BLF可以提高奶牛乳蛋白的含量，改善奶牛泌乳性能。然而，BLF如何調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)乳蛋白的合成及其作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究旨在通過添加BLF與BMECs共培養(yǎng)，以期闡明BLF對奶牛乳腺抗氧化及乳蛋白合成的影響及其作用機(jī)制，為BLF在奶牛生產(chǎn)方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BMECs由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈；竹葉選購自陜西某天然制品有限公司，BLF參照張英[19]的方法由本實(shí)驗(yàn)室采用熱回流法自行提取，提取效率1%～3%，總黃酮含量為20%～26%；DMEM/F12培養(yǎng)基(11995065,11765054)、澳洲胎牛血清(FBS,10099141)、青霉素/鏈霉素溶液(Pen Strep,15140-122)、Hank’s平衡鹽溶液(HBSS,14175095)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(25200056)購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京沃比森科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)活力檢測試劑盒(Lot.GB707)購自日本同仁化學(xué)研究所；活性氧(ROS)檢測試劑盒(S0033S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)活性定量測定試劑盒(E1020)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(ZP327-1)購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(A001-1-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(A005-1-2)、MDA試劑盒(A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所；線粒體膜電位(MMP)水平測定采用Thermo公司的MitoProbeTMJC-1 Assay Kit(M34652)試劑盒；總RNA提取試劑盒(12183018A)購自賽默飛公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ購自日本TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將BMECs置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳至3～5代，然后分別更換為添加了不同濃度(0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0、100.0 μg/mL)BLF的DMEM/F-12(含有10% FBS)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3、6、12、24和48 h后收集細(xì)胞，每次試驗(yàn)平行復(fù)孔6個，重復(fù)試驗(yàn)3次。通過CCK-8檢測細(xì)胞活性，LDH法檢測BMECs的毒性；采用對應(yīng)試劑盒分析BMECs細(xì)胞凋亡、ROS含量、MMP水平、T-SOD與GSH-Px活性和MDA含量；并采用實(shí)時熒光定量 PCR(qRT-PCR)法檢測凋亡相關(guān)基因和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路中相關(guān)基因表達(dá)量的變化。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 BMECs的傳代培養(yǎng)

用適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化BMECs，待細(xì)胞消化完全時，用含有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行終止消化，離心(500×g，10 min)、去上清后，將收集的細(xì)胞用DMEM/F-12(含有10% FBS)重懸，并于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BMECs，傳至3～5代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 不同濃度BLF溶液的配制

稱取10 mg BLF用二甲基亞砜(DMSO)溶解，然后將溶解的BLF溶液(初始儲存濃度為100.0 μg/mL)加入到細(xì)胞完全培養(yǎng)液中，通過倍比稀釋調(diào)整BLF濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0和100.0 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 BLF對BMECs活性影響

將BMECs以每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，分別更換為含有不同濃度(0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0、100.0 μg/mL)BLF的150 μL DMEM/F-12(含有10% FBS，1%青-鏈霉素)培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、12、24和48 h。每次試驗(yàn)平行復(fù)孔6個，重復(fù)試驗(yàn)3次。然后按照CCK-8活力檢測試劑盒說明書每孔加入15 μL的CCK-8檢測液，在細(xì)胞培養(yǎng)中繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度值(OD450 nm)。

細(xì)胞相對增殖率(%)=100×試驗(yàn)組OD450 nm/對照組OD450 nm。

1.3.4 BLF對BMECs毒性的影響

將BMECs接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，用PBS進(jìn)行清洗并每孔加入2 mL含有不同濃度(0、1.0、5.0、10.0 μg/mL)BLF的細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后按照LDH試劑盒說明使用酶標(biāo)儀在440 nm處測定吸光度值(OD440 nm)，計(jì)算酶活力單位。細(xì)胞LDH釋放率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞LDH釋放率(%)=細(xì)胞培養(yǎng)基中測定的酶活力單位/(細(xì)胞裂解液測定的酶活力單位+細(xì)胞培養(yǎng)基測定的酶活力單位)×100。

1.3.5 BLF對BMECs凋亡的影響

將BMECs接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，用PBS進(jìn)行清洗并添加2 mL含有不同濃度(0、1.0、5.0、10.0 μg/mL)BLF的DMEM/F-12(含有10% FBS，1%青-鏈霉素)培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書，在200 μL含有5 μL Annexin V-FITC的結(jié)合緩沖液中室溫和黑暗條件下染色20 min，在4 ℃的黑暗中再染色15 min，然后加入10 μL PI，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 BLF對BMECs ROS含量的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進(jìn)行培養(yǎng)和處理。隨后，加入二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)，在37 ℃孵育30 min后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。然后用流式細(xì)胞儀檢測20 000個細(xì)胞的2′,7′-二氯熒光素(DCF)熒光分布，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.3.7 BLF對BMECs MMP水平的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進(jìn)行培養(yǎng)和處理。隨后，加入JC-1染料工作液，37 ℃孵育30 min，之后在37 ℃下用10 μmol/L的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(CCCP)處理細(xì)胞30 min，再用JC-1染料工作液于37 ℃孵育30 min后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的JC-1染料，使用流式細(xì)胞儀在530 nm處測量MMP水平。

1.3.8 BLF對BMECs抗氧化酶活性的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進(jìn)行培養(yǎng)和處理。隨后，按照試劑盒說明使用酶標(biāo)儀分別在532、550和412 nm的吸收波長下測定MDA、T-SOD和GSH-Px的吸光度，并計(jì)算MDA含量及T-SOD和GSH-Px活性。

1.3.9 BLF對BMECs凋亡及mTOR通路相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進(jìn)行培養(yǎng)和處理。然后，按照總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，之后采用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。然后，以三磷酸-甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，采用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測凋亡及mTOR通路相關(guān)基因相對表達(dá)量。實(shí)時熒光定量PCR采用兩步法進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；60 ℃退火30 s，60 ℃延伸5 s，40個循環(huán)。引物序列及參數(shù)見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。首先，采用Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的初步整理，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 7.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BLF對BMECs活性的影響

如圖1所示，與對照組相比，只有添加100.0 μg/mL的BLF組細(xì)胞存活率逐漸降低且低于對照組，添加0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0 μg/mL的BLF均可提高細(xì)胞存活率，且不同濃度BLF與BMECs共培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞存活率最高。因此,12 h是BLF作用的最適時間；其中，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF與BMECs共培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞存活率為128.60%～141.51%，效果較好。因此選擇添加BLF的濃度為1.0、5.0和10.0 μg/mL進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖1 BLF對BMECs活性的影響Fig.1 Effects of BLF on BMECs viability

2.2 BLF對BMECs毒性的影響

如圖2所示，BLF對BMECs無毒性作用。在37 ℃條件下添加5.0和10.0 μg/mL的BLF均可顯著降低LDH的釋放率(P<0.05)，其中5.0 μg/mL BLF效果最好。

2.3 BLF對BMECs凋亡的影響

Annexin V和PI雙重染色將細(xì)胞分為3類：Annexin V和PI均為陰性的活細(xì)胞；Annexin V為陽性，PI為陰性的早期凋亡細(xì)胞；Annexin V和PI均為陽性的晚期凋亡/壞死細(xì)胞(圖3-A)。如圖3-B所示，與對照組相比，在37 ℃條件下添加5.0、10.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，極顯著降低細(xì)胞早期凋亡率和晩期凋亡/壞死率(P<0.01)。添加1.0、5.0和10.0 μg/mL的BLF極顯著降低總凋亡率(P<0.01)。

與對照組比較，“*”為差異顯著(P<0.05)，“**”為差異極顯著(P<0.01)。下圖同。Compared with control group, “*” mean significant difference (P<0.05)， and with “**” mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.圖2 BLF對BMECs毒性的影響Fig.2 Effects of BLF on BMECs cytotoxicity

2.4 BLF對BMECs ROS含量的影響

如圖4所示，與對照組相比，添加5.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，可以極顯著減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P<0.01)。

2.5 BLF對BMECs MMP水平的影響

如圖5所示，與對照組相比，添加5.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，可以極顯著降低細(xì)胞內(nèi)MMP水平(P<0.01)。

2.6 BLF對BMECs抗氧化指標(biāo)的影響

如圖6所示，與對照組相比，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，可以極顯著升高T-SOD、GSH-Px的活性(P<0.01)，極顯著降低MDA含量(P<0.01)。

圖6 BLF對BMECs中T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響Fig.6 Effects of BLF on T-SOD and GSH-Px activities and MDA content in BMECs

2.7 BLF對BMECs凋亡相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

如圖7所示，添加5.0 μg/mL的BLF可顯著降低B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因相對表達(dá)量(P<0.05)；1.0、5.0和10.0 μg/mL的BLF均可極顯著提高B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(Bcl-2)基因的相對表達(dá)量(P<0.01)，極顯著降低Bax/Bcl-2的比值(P<0.01)；添加5.0和10.0 μg/mL的BLF顯著降低環(huán)氧合酶-2(COX-2)的基因相對表達(dá)量(P<0.05)，極顯著降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的基因相對表達(dá)量(P<0.01)。由此說明，添加BLF可降低奶牛BMECs凋亡相關(guān)基因相對表達(dá)量。

圖7 BLF對BMECs凋亡相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of BLF on relative expression levels of apoptosis related genes in BMECs

2.8 BLF對BMECs中mTOR信號通路中相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

如圖8所示，添加1.0、5.0和10.0 μg/mL的BLF能極顯著上調(diào)mTOR、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)和β-酪蛋白(β-casein)的基因相對表達(dá)量(P<0.01)；添加5.0和10.0 μg/mL的BLF極顯著升高真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(EIF-4EBP1)的基因相對表達(dá)量(P<0.01)。由此說明，添加BLF可通過mTOR信號通路調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響B(tài)MECs中乳蛋白合成。

圖8 BLF對BMECs中mTOR信號通路關(guān)鍵調(diào)控基因相對表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of BLF on relative expression levels of key regulatory genes in mTOR signaling pathway

3 討 論

BLF作為一種天然植物提取物，已被證實(shí)具有清除氧自由基、提高機(jī)體免疫力以及抗氧化等生物學(xué)功能[20-21]，但對其對BMECs抗氧化及乳蛋白的合成及其作用機(jī)制尚未明確。為進(jìn)一步揭示BLF對BMECs的抗氧化及乳蛋白合成的影響，本研究展開了對細(xì)胞活性和毒性、細(xì)胞凋亡、ROS含量、MMP水平以及抗氧化能力的檢測，并通過實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測了凋亡相關(guān)基因和mTOR信號通路相關(guān)基因相對表達(dá)量的變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF與BMECs共培養(yǎng)12 h后，可顯著提高細(xì)胞增殖能力及其活性，無毒性作用，且5.0 μg/mL效果最好。這與張師[22]研究結(jié)果相一致，BLF可以顯著提高四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝損傷的細(xì)胞存活率。此外，于馮[23]的研究結(jié)果表明，0.1～10.0 μg/mL的BLF能夠促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖。因此，BLF可提高細(xì)胞存活率，對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

A圖為流式細(xì)胞儀檢測Annexin V/PI雙染結(jié)果；B圖為BLF對細(xì)胞凋亡率的影響。Figure A showed the results of Annexin V/PI double staining by flow cytometry; figure B showed the effects of BLF on apoptosis rate of cells.圖3 BLF對BMECs凋亡的影響Fig.3 Effects of BLF on BMECs apoptosis

泌乳期奶牛BMECs對能量的需求增加，細(xì)胞代謝速度提高，導(dǎo)致ROS生成量增多[24]。當(dāng)機(jī)體生成和清除ROS的動態(tài)平衡被打破時，將引起氧化應(yīng)激的發(fā)生，過量的ROS會使BMECs損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。同時，過量的ROS會攻擊細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化，從而產(chǎn)生MDA[26]。此外，動物體內(nèi)存在抗氧化酶系統(tǒng)，包括SOD、CAT以及GSH-Px[27]，清除過量的ROS，使細(xì)胞免受氧化損傷[28]。因此，有效降低氧化應(yīng)激的損傷，提高BMECs的抗氧化能力，對提高奶牛的泌乳性能具有重要的作用。本研究結(jié)果顯示，BLF可以極顯著降低BMECs內(nèi)ROS的生成，并極顯著升高T-SOD、GSH-Px活性及降低MDA的含量，從而減輕BMECs細(xì)胞凋亡和線粒體損傷，提高抗氧化能力。張守麗等[29]研究表明，BLF可以顯著降低人肝癌HepG2細(xì)胞的MDA和ROS含量，從而緩解油酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。王丹丹[11]發(fā)現(xiàn)一定濃度的BLF可以提高被過氧化氫(H2O2)氧化損傷的細(xì)胞SOD、CAT和GSH-Px活性，降低細(xì)胞MDA含量。張碩[30]研究表明，BLF可以顯著提高仙居雞血清SOD、CAT和GSH-Px活性，降低MDA含量，與本研究結(jié)果一致。MMP是指線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子分布不對稱而形成的電化學(xué)梯度，細(xì)胞凋亡早期MMP水平就會發(fā)生改變，出現(xiàn)下降現(xiàn)象[31]。王丹丹[11]研究表明，200.0 μg/mL的BLF可以提高被H2O2氧化損傷的大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞系PC12細(xì)胞的MMP水平。Yu等[32]發(fā)現(xiàn)，BLF可以顯著降低HepG2細(xì)胞的MMP水平。與本研究結(jié)果BLF可以極顯著降低BMECs內(nèi)MMP水平相一致。因此，BLF可減少BMECs內(nèi)ROS積累和MMP水平，提高抗氧化能力，從而減輕BMECs凋亡和線粒體損傷。

A圖為流式細(xì)胞儀檢測ROS結(jié)果；B圖為BLF對ROS含量的影響。Figure A showed the results of ROS detected by flow cytometry; Figure B showed the effects of BLF on ROS content.圖4 BLF對BMECs ROS含量的影響Fig.4 Effects of BLF on ROS content in BMECs

在細(xì)胞生長發(fā)育過程中正常的細(xì)胞凋亡發(fā)揮了維持細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定的作用[33]。BMECs的數(shù)量和活力，決定了奶牛的泌乳性能。因此，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖對提高BMECs的泌乳能力具有重要的意義。現(xiàn)有研究表明，細(xì)胞凋亡的信號調(diào)控有3個關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)：Bcl-2家族、Caspase家族和線粒體途徑。

A圖為流式細(xì)胞儀檢測MMP 的結(jié)果(FITC-A，綠色熒光；PE-A，紅色熒光)；B圖為BLF對細(xì)胞內(nèi)MMP水平的影響。Figure A showed the results of MMP by flow cytometry (FITC-A, green fluorescence; PE-A, red fluorescence); Figure B showed the effects of BLF on intracellular MMP level.圖5 BLF對BMECs MMP水平的影響Fig.5 Effects of BLF on MMP level in BMECs

Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員[34-36]，Bcl-2可阻斷Bax的促凋亡作用以及阻止細(xì)胞色素c的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡[37]。通過抑制促凋亡因子的釋放，Bcl-2蛋白家族可抑制Caspase蛋白的活性，發(fā)揮抗凋亡的作用[35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加BLF可顯著降低Bax和Caspase-3基因相對表達(dá)量，并且可極顯著提高Bcl-2的基因相對表達(dá)量，證明BLF對細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。而且研究表明，Bax/Bcl-2的比值較高可能會誘導(dǎo)Caspase-3的水平升高[38]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，BLF顯著降低了Bax/Bcl-2的比值，抑制了Caspase-3基因相對表達(dá)量。此外，COX-2是前列腺素合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，在正常細(xì)胞內(nèi)活性較低[39]。但在細(xì)胞受到炎性反應(yīng)等刺激時，會誘導(dǎo)COX-2表達(dá)量提高[40]。龐磊[41]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧后COX-2表達(dá)量上升，引發(fā)細(xì)胞凋亡，而使用COX-2活性抑制劑后，可降低缺氧/復(fù)氧介導(dǎo)的H9C2心肌纖維細(xì)胞凋亡。本研究中添加BLF可顯著降低COX-2基因相對表達(dá)量，從而提高了細(xì)胞的存活率。因此，BLF可顯著抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，對細(xì)胞的凋亡具有抑制作用。

據(jù)報(bào)道，mTOR信號通路與BMECs的細(xì)胞增殖和乳蛋白合成密切相關(guān)[42]。乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中β-酪蛋白含量一般較高。乳蛋白合成通路主要有3條[43]，分別是Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路、mTOR信號通路以及阻遏蛋白激酶2/真核翻譯起始因子2α(GCN2-eIF2a)信號通路。值得注意的是，mTOR信號通路主要在調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯中起作用[43-44]，mTOR廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中，可參與基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、核糖體合成、凋亡等多種生命活動[44]。目前研究發(fā)現(xiàn)，mTOR包括2種復(fù)合物，分別是mTORC1和mTORC2[45]，其中mTORC1主要調(diào)控蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖?，F(xiàn)有研究表明，mTOR上游信號通路是磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)，PI3K被激活后，進(jìn)一步作用于蛋白激酶B(AKT)，而活化的AKT基因可以直接作用于mTOR，使下游的EIF-4EBP1及S6K1磷酸化，從而促進(jìn)乳蛋白的合成[43,46]。本研究結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)條件下，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF可極顯著提高BMECs中mTOR信號通路關(guān)鍵調(diào)控基因mTOR和S6K1的基因相對表達(dá)量，添加5.0、10.0 μg/mL的BLF可極顯著提高BMECs中mTOR信號通路關(guān)鍵調(diào)控基因EIF-4EBP1基因相對表達(dá)量，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF可極顯著提高β-酪蛋白基因相對表達(dá)量，由此可見，BLF可通過mTOR信號通路中關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)，從而影響B(tài)MECs合成乳蛋白的能力。

賈若愚[47]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼糧中添加30.0和60.0 g/d的BLF可以分別提高0.03和0.06 kg/d的乳蛋白產(chǎn)量。然而，BLF如何通過mTOR信號通路的關(guān)鍵因子影響乳蛋白的合成有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。特別是，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量蛋白組學(xué)鑒定和蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)，為更好地揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)與規(guī)律，提供了全新的研究思路和技術(shù)手段。因此，本研究為進(jìn)一步應(yīng)用組學(xué)方法研究BLF影響B(tài)MECs合成乳蛋白的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，添加BLF可顯著上調(diào)BMECs中mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高該信號通路關(guān)鍵基因相對表達(dá)量，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié) 論

在體外培養(yǎng)的條件下，添加BLF可顯著提高BMECs的活性；同時，BLF可以通過降低BMECs內(nèi)ROS的生成、MMP水平，降低凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到減少細(xì)胞凋亡和線粒體損傷的作用；此外，BLF可以通過mTOR信號通路，影響乳的合成，其中添加5.0 μg/mL的BLF效果最為顯著。