夏 億，孟禹璇，丁斌鷹，王 蕾，趙 迪，郭雙雙，侯永清

（武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

農(nóng)業(yè)部第194號(hào)公告表明，自2020年7月1日起，飼料企業(yè)停止生產(chǎn)含有抗生素等促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，隨著飼料中抗生素減少，一部分禽畜疾病有增多的趨勢(shì)，如產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的壞死性腸炎就是其中的一種。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染因損傷動(dòng)物腸道，易傳染，嚴(yán)重時(shí)破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)引起毒血癥，導(dǎo)致動(dòng)物死亡等特點(diǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。歐盟部分國(guó)家數(shù)據(jù)表明，雞群感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后，死亡率上升，發(fā)病率為3%～10%，由亞臨床癥狀造成的經(jīng)濟(jì)損失占到生產(chǎn)成本的10%。因此，在飼料無(wú)抗的背景趨勢(shì)下提高生產(chǎn)效益成為焦點(diǎn)問(wèn)題，尋找安全，高效，綠色無(wú)污染的抗生素替代物成為當(dāng)前最重要的任務(wù)之一。

益生菌有改善腸道環(huán)境，降低腸道有害菌數(shù)量，且具備分泌多種消化酶促進(jìn)腸道消化吸收等有益作用，被認(rèn)為是良好的抗生素替代品。在益生菌的生理研究過(guò)程中，目前研究的重點(diǎn)是調(diào)節(jié)腸道功能。發(fā)酵乳桿菌（，LF）是腸道固有乳酸桿菌之一，主要通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞比例發(fā)揮對(duì)宿主免疫發(fā)育及免疫調(diào)節(jié)的積極作用。凝結(jié)芽孢桿菌（，BC）是產(chǎn)乳酸芽孢桿菌，具有較廣的抗菌譜，能提高機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫水平和抗病能力。前期研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌均對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞的腸道微生物具有調(diào)控作用，且添加凝結(jié)芽孢桿菌一定程度上提高了肉雞的生長(zhǎng)性能，同時(shí)有利于腸道絨毛發(fā)育?；谇捌谘芯?，本試驗(yàn)探究了兩種益生菌對(duì)感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的肉雞免疫和腸道屏障功能的影響，為益生菌在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，發(fā)酵乳桿菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，凝結(jié)芽孢桿菌（活菌數(shù)為1×10CFU/g）由湖北浩華生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及肉雞飼養(yǎng)管理與夏億等的相同，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)公母各半和體重相近的原則，將336只1日齡愛(ài)拔益加肉仔雞（購(gòu)自湖北荊州正康家禽公司）隨機(jī)分成4個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)14只雞。對(duì)照組和感染組肉雞飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。感染+LF組和感染+BC組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加1×10和1×10CFU/kg的發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌。試驗(yàn)期28 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌感染 將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種到含牛肉粒的皰肉培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)16 h后，活菌數(shù)調(diào)整為1×10CFU/mL，皰肉培養(yǎng)基和牛肉粒購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。參照Du等方法建立產(chǎn)氣莢膜梭菌感染模型，所有感染組肉雞從第14～21日齡連續(xù)經(jīng)口接種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌新鮮菌液，每只雞每天接種1 mL。對(duì)照組肉雞灌喂1 mL不含產(chǎn)氣莢膜梭菌的肉湯培養(yǎng)基。

1.4 樣品采集 于試驗(yàn)第21和28天，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取公雞和母雞各1只，翅下靜脈采血，待血清析出后，3 000 r/min離心10 min，取上清分裝，于-80℃冰箱保存待測(cè)。取十二指腸、空腸、回腸中間部分（長(zhǎng)約10 cm），剖開腸段后用預(yù)冷的無(wú)RNA酶水沖洗腸道內(nèi)容物，刮取腸黏膜，置于無(wú)RNA酶離心管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存待測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定 在第28天早上，以重復(fù)為單位測(cè)定肉雞空腹體重，記錄全期采食量同時(shí)觀察健康狀況，計(jì)算肉雞全期的平均日增重、平均日采食量和耗料增重比。

1.5.2 血清溶菌酶含量的測(cè)定 按照溶菌酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書的要求，采用比濁法測(cè)定血清中溶菌酶含量。

1.5.3 血清免疫球蛋白（IgA和IgG）含量的測(cè)定 采用ELISA法定量測(cè)定血清中IgA和IgG含量，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bethyl Laboratories公司。向96孔酶標(biāo)板每孔加入100 μL稀釋后的包被抗體，37℃孵育1 h，然后洗滌5次，甩干后每孔加入200 μL阻斷液，37℃孵育30 min，洗滌5次，甩干后每孔中加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，37℃孵育1 h，洗滌5次，甩干后每孔中加入100 μL稀釋后的鏈霉親和素標(biāo)記的HRP，37℃孵育1 h，洗滌5次，甩干后每孔中加入100 μL TMB顯色液，37℃避光孵育15 min，每孔加入100 μL終止液，用酶標(biāo)儀（SpectraMax190，Molecular Devices，美國(guó)）在450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光值計(jì)算血清中IgA和IgG含量。

1.5.4 腸黏膜免疫與屏障基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)將十二指腸、空腸和回腸黏膜樣品于液氮中研磨，采用RNAiso Plus試劑（TaKaRa，大連）提取各樣本的總RNA，RNA的濃度和純度用Nanodrop進(jìn)行測(cè)定。根 據(jù)PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，大連）的方法，取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa，大連）在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500，ThermoFisher Scientific，美國(guó)）上進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定。檢測(cè)的免疫相關(guān)基因包括白介素-4（）、白介素-8（）、腫瘤壞死因子（-）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（）、多聚免疫球蛋白受體（）和禽-防御素（AvBD1、、），屏障結(jié)構(gòu)相關(guān)基因?yàn)殚]鎖小帶蛋白-1（ZO-1）、閉合蛋白（）、連接蛋白-1（）和黏蛋白-2（）。以-為內(nèi)參基因，以對(duì)照組為參照，采用2法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量?；虻囊镄蛄幸姳?，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對(duì)照組和感染組間采用Students′檢驗(yàn)進(jìn)行分析，顯著性用a、b表示。感染組、感染+LF組、感染+BC組之間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），當(dāng)差異顯著時(shí)，采用鄧肯氏多重比較進(jìn)一步分析，顯著性用x、y、z表示。以≤0.05為差異顯著，以0.05<<0.10為有差異顯著的趨勢(shì)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 益生菌對(duì)感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響 由表3可知，與對(duì)照組相比，感染組肉雞的平均日采食量降低（<0.05），平均日增重和耗料增重比在4個(gè)處理組間無(wú)顯著變化。

表3 益生菌對(duì)感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 益生菌對(duì)感染肉雞血清溶菌酶活性和免疫球蛋白含量的影響 由表4可知，與對(duì)照組相比，感染組血清溶菌酶活性沒(méi)有顯著變化，但是有增加第21日齡血清IgA含量的趨勢(shì)（=0.06），降低了第28日齡血清IgG含量（<0.05）。與感染組相比，添加兩種益生菌均降低了第21日齡血清溶菌酶活性和IgA含量（<0.05），感染+BC組降低了第28日齡血清溶菌酶活性（<0.05），但是兩種益生菌對(duì)第28日齡血清免疫球蛋白水平?jīng)]有顯著影響。

表4 益生菌對(duì)感染肉雞血清溶菌酶活性和免疫球蛋白含量的影響

2.3 益生菌對(duì)感染肉雞腸道免疫基因表達(dá)的影響 由表5可知，在第21日齡，與對(duì)照組相比，感染組上調(diào)了十二指腸、、AvBD1和，空腸和，以及回腸的mRNA表達(dá)（<0.05）。與感染組相比，添加兩種益生菌下調(diào)了空腸以及回腸表達(dá)，上調(diào)了空腸-表達(dá)（<0.05）；感染+LF組上調(diào)了空腸和回腸-表達(dá)，下調(diào)了回腸表達(dá)（<0.05）；感染+BC組上調(diào)了十二指腸表達(dá)，下調(diào)了十二指腸和空腸表達(dá)（<0.05）。

表5 21日齡肉雞腸道黏膜免疫基因的相對(duì)表達(dá)量

由表6可知，在第28日齡，與對(duì)照組相比，感染組上調(diào)了十二指腸和以及回腸表達(dá)（<0.05）。與感染組相比，添加2種益生菌均下調(diào)了十二指腸表達(dá)，上調(diào)了空腸和表達(dá)（<0.05）；感染+LF組下調(diào)了十二指腸表達(dá)，上調(diào)了空腸表達(dá)（<0.05）；感染+BC組下調(diào)了十二指腸-和回腸表達(dá)，上調(diào)了空腸表達(dá)（<0.05）。

表6 28日齡肉雞腸道黏膜免疫基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 益生菌對(duì)感染肉雞腸道屏障基因表達(dá)的影響 由表7可知，在第21日齡，與對(duì)照組相比，感染組上調(diào)了十二指腸和空腸ZO-1、和，以及回腸和表達(dá)（<0.05）。與感染組相比，添加兩種益生菌均下調(diào)了十二指腸和以及回腸表達(dá)，上調(diào)了十二指腸ZO-1表達(dá)（<0.05）；感染+BC組上調(diào)了空腸和的相對(duì)表達(dá)量（<0.05）。

表7 21日齡肉雞腸道緊密連接蛋白和黏蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量

由表8可知，在第28日齡，與對(duì)照組相比，感染組上調(diào)了十二指腸和空腸表達(dá)（<0.05）。與感染組相比，添加兩種益生菌均下調(diào)了小腸、十二指腸和回腸以及十二指腸的相對(duì)表達(dá)量（<0.05）；感染+LF組上調(diào)了空腸ZO-1表達(dá)（<0.05）。

表8 28日齡肉雞腸道緊密連接蛋白和黏蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

3.1 益生菌對(duì)感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響 產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖能引起壞死性腸炎，對(duì)肉雞的健康和生產(chǎn)效益造成一定的負(fù)面影響，因此本試驗(yàn)擬探究飼糧中添加益生菌能否緩解產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的壞死性腸炎。趙娜等研究表明，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌能增加肉雞的平均日增重和平均日采食量。在球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染模型下，肉雞飼糧中添加400 mg/kg 凝結(jié)芽孢桿菌有增加體重的趨勢(shì)。本試驗(yàn)中，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染降低了肉雞的平均日采食量，添加益生菌沒(méi)有顯著緩解采食量的降低，但是感染+BC組的平均日采食量與對(duì)照組較為接近。

3.2 益生菌對(duì)感染肉雞血清溶菌酶活性和免疫球蛋白含量的影響 溶菌酶普遍存在于動(dòng)物機(jī)體的多種組織和分泌液中，被認(rèn)為是反映機(jī)體非特異性免疫的重要依據(jù)。劉丹報(bào)道，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染后第1天肉雞血清溶菌酶活性顯著降低，感染后第7天溶菌酶活性沒(méi)有顯著變化。Deon等研究表明，飼糧中添加由乳酸桿菌和芽孢桿菌組成的復(fù)合益生菌增加了沙門氏菌感染肉雞的血清溶菌酶活性。本試驗(yàn)中，添加發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌降低了感染肉雞的血清溶菌酶活性，這可能是由于2種益生菌減少了腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。血清IgA能以非炎癥的形式清除大量抗原，這對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用。IgG在家禽體內(nèi)主要由脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)的漿細(xì)胞分泌和合成，當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，與抗原特異性結(jié)合的IgG由家禽免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，因此機(jī)體的免疫能力可通過(guò)檢測(cè)免疫球蛋白IgG含量來(lái)體現(xiàn)。申維維等報(bào)道，向肉雞飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可提高14日齡肉雞血清中IgG含量。張彩風(fēng)等發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加0.1%乳酸菌和酵母菌復(fù)合菌劑可以升高21日齡肉仔雞血清IgG含量。本試驗(yàn)中，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染降低了28日齡的血清IgG水平，添加益生菌雖然沒(méi)有顯著改變IgG含量，但是益生菌組的IgG水平介于對(duì)照組和感染組之間。

3.3 益生菌對(duì)感染肉雞腸道免疫基因表達(dá)的影響 IL-4作為抗炎性因子，其表達(dá)水平在急性感染和自身免疫中存在差異。孫玉麗等報(bào)道，在飼糧中添加葡聚糖可使肉仔雞在感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后第14天血清中IL-4含量顯著提高。本試驗(yàn)中，飼糧添加發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌上調(diào)了28日齡空腸基因的表達(dá)。IL-8是具有生物活性的多肽物質(zhì)，也是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)中早期的炎癥細(xì)胞因子。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染上調(diào)了第21日齡肉雞空腸和回腸基因的表達(dá)，這與倪學(xué)勤等的研究結(jié)果相吻合，表明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染激發(fā)了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致促炎性因子基因上調(diào)。添加兩種益生菌均下調(diào)了第21日齡肉雞空腸基因表達(dá)，發(fā)酵乳桿菌下調(diào)了回腸基因表達(dá)，緩解了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的炎癥反應(yīng)。

iNOS主要存在于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞中，在細(xì)胞受到刺激后以-精氨酸為底物生成大量NO，并利用NO的氧化應(yīng)激協(xié)助巨噬細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，從而對(duì)抗病原體。王俊峰等研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染提高了肉雞血清iNOS含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染上調(diào)了第21日齡十二指腸基因表達(dá)，飼糧添加發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌下調(diào)了第28日齡肉雞十二指腸基因表達(dá)，說(shuō)明兩種益生菌緩解了感染肉雞的腸道炎癥反應(yīng)。pIgR能介導(dǎo)免疫球蛋白多聚體在上皮細(xì)胞中的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，使免疫球蛋白在黏膜局部發(fā)揮抵抗病原菌的作用。本研究顯示，凝結(jié)芽孢桿菌上調(diào)了感染肉雞第21日齡十二指腸基因的相對(duì)表達(dá)量，這表明凝結(jié)芽孢桿菌提高了腸道局部免疫力。當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染，或受到炎癥因子、引起天然免疫的細(xì)菌因子等刺激時(shí)，可誘導(dǎo)防御素表達(dá)。Hong研究表明，在艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌共同感染的情況下，肉雞空腸和的基因表達(dá)顯著上調(diào)，腸道基因表達(dá)無(wú)顯著差異。張貝貝等發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染第21日齡肉仔雞，飼糧中添加精氨酸顯著降低了的mRNA表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染上調(diào)了第21日齡肉雞十二指腸和以及空腸基因相對(duì)表達(dá)量，而添加凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)這些基因的表達(dá)有下調(diào)作用，表明凝結(jié)芽孢桿菌緩解了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

3.4 益生菌對(duì)感染肉雞腸道屏障基因表達(dá)的影響Occludin是最先被發(fā)現(xiàn)的跨膜緊密連接蛋白，在維持細(xì)胞極性中具有重要地位。杜恩存發(fā)現(xiàn)飼糧中添加植物精油顯著下調(diào)了第21日齡肉仔雞感染球蟲后空腸的mRNA表達(dá)量。本試驗(yàn)表明，添加發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌普遍下調(diào)了小腸基因的相對(duì)表達(dá)量，但是并未降低腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性。腸道上皮細(xì)胞間通過(guò)多種蛋白和分子形成緊密連接結(jié)構(gòu)，而claudin蛋白可加強(qiáng)緊密連接結(jié)構(gòu)的緊密性。Weber等研究表明，炎癥性腸炎中腸道表達(dá)增加。本試驗(yàn)也表明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染普遍上調(diào)了肉雞小腸相對(duì)表達(dá)量，而飼糧添加發(fā)酵乳桿菌或凝結(jié)芽孢桿菌下調(diào)了腸道相對(duì)表達(dá)量，這表明益生菌有緩解腸道炎癥的作用。在小腸中是主要的黏蛋白基因，在杯狀細(xì)胞中能編碼分泌黏蛋白，產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的水解酶可降解黏液糖蛋白，破壞黏液屏障。本研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染上調(diào)了第21日齡空腸基因相對(duì)表達(dá)量，這可能是由于感染引起黏液降解，從而刺激黏蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)黏液分泌。添加發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌下調(diào)了感染肉雞腸道的表達(dá)，可能是由于益生菌抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖，緩解了黏液層損傷。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌均能緩解產(chǎn)氣莢膜梭菌感染造成的肉雞炎癥反應(yīng)，調(diào)控腸道緊密連接蛋白和黏蛋白基因的表達(dá)。