潘彩霞

（中國刑事警察學(xué)院警犬技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽 110000）

近年來，伴隨著寵物犬行業(yè)興起，犬人工授精技術(shù)發(fā)揮越來越重要的作用，而犬精液保存技術(shù)大大提高了人工授精技術(shù)的效率。與精液常溫和低溫保存技術(shù)相比，精液冷凍保存技術(shù)不僅能將精液長期保存，還能實現(xiàn)優(yōu)良的公犬精液長距離運輸，提高公犬生產(chǎn)性能，加快品種改良，提高犬精液冷凍保存技術(shù)對犬業(yè)發(fā)展意義重大。

盡管精液冷凍保存技術(shù)越來越普及，但解凍后的犬精液的授精效果仍不穩(wěn)定，主要原因是正常情況下精液自身具有完善的抗氧化系統(tǒng)，但經(jīng)過冷凍處理精液的抗氧化平衡被打破，解凍后的精子細(xì)胞內(nèi)存在高濃度的活性氧（ROS），會與精子質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低精子的運動性能及受精能力，甚至導(dǎo)致精子死亡。除此之外，相比于牛、羊等動物的精子，犬精子細(xì)胞膜中的膽固醇∶卵磷脂比例更高，更多的不飽和脂肪酸會使精子對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)更加敏感，抗凍能力更差。

為減少精液冷凍保存過程中的過氧化損傷，在精液稀釋液中加入適量的抗氧化物質(zhì)可以提高精子的總抗氧化能力。二甲雙胍是一種已被廣泛應(yīng)用的II型糖尿病以及糖代謝綜合征的有效口服雙胍類抗高血糖藥。最新研究顯示，二甲雙胍在抗氧化性方面同樣具有顯著效果，其作用機理普遍認(rèn)為是通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)而產(chǎn)生作用。在小鼠精液冷凍保存中，二甲雙胍可以提高精子的體外受精率，減少異常受精卵數(shù)量。也有研究顯示，在同羊精液冷凍保存稀釋液中添加二甲雙胍可以降低精子在冷凍保存過程中的氧化損傷，提高冷凍-解凍后精液品質(zhì)。然而，目前關(guān)于二甲雙胍對犬精液冷凍保存效果的影響尚不清楚。本試驗嘗試用含有一定比例二甲雙胍的稀釋液冷凍保存犬精液，分析二甲雙胍對冷凍-解凍后犬精液品質(zhì)的影響，以期為二甲雙胍在犬精液冷凍保存技術(shù)中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。由于在不同類型細(xì)胞中用于限制線粒體呼吸鏈復(fù)合體的二甲雙胍濃度一般<100 μmol/L，且在接受治療的糖尿病患者體內(nèi)二甲雙胍含量檢測值一般為40～70 μmol/L。因此本研究選擇0～100 μmol/L的二甲雙胍濃度開展試驗，確保在獲取最佳添加濃度的同時，減少可能對生殖細(xì)胞造成的副作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇相貌體型好、3～5歲、有過配種經(jīng)驗的優(yōu)秀德國牧羊犬種公犬5頭，由公安部沈陽警犬基地提供。采精前后保證其正常日糧供應(yīng)及飲水。Tris、檸檬酸、葡萄糖、二甲雙胍、各類檢測試劑盒等均購自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 精液采集與處理 采用手握按摩法對犬進(jìn)行精液采集，并收集富含精子段精液。精液量3～5 mL，最低精子密度1.0×10個/mL，精子活力在85%以上才能用于冷凍保存。Tris-卵黃稀釋液配制：Tris 2.4 g，檸檬酸1.4 g，葡萄糖 0.8 g，鏈霉素 0.1 g，青霉素 0.06 g（0.3 mL雙蒸水中），甘油 7 mL，卵黃 20 mL，用雙蒸水定容至100 mL。將每次采集的精液混合均勻以消除個體差異。將精液平均分為4等份，在37℃下700 r/min離心10 min，去除上層精清，然后分別加入含有不同濃度（0、25、50、100 μmol/L)二甲雙胍的Tris-卵黃稀釋液，調(diào)整精液密度至1.0×10個/mL，其中0 μmol/L為對照組。

1.2.2 冷凍與解凍 用自動化細(xì)管灌裝機將稀釋后的精液灌注到0.5 mL精液細(xì)管中并封口，在4℃冰箱內(nèi)平衡2 h。將平衡好的細(xì)管精液置于距液氮面4 cm處，蓋蓋熏蒸10 min后，直接投入液氮中。解凍時，將細(xì)管精液取出，迅速投入37℃水浴鍋中，輕輕晃動30 s，使精液快速溶解。擦拭干凈細(xì)管表面水分，剪去細(xì)管兩端，把精液倒入離心管中，進(jìn)行精液品質(zhì)檢測。

1.2.3 冷凍-解凍后精子活力的測定 用移液槍取10 μL精液放在經(jīng)37℃恒溫載物臺預(yù)熱過的載玻片上，蓋上蓋玻片置于400倍相差顯微鏡下觀察，相差顯微鏡配備北昂醫(yī)學(xué)圖像軟件（BEION V4.20），對精子活力進(jìn)行分析計算。每次隨機選擇5個視野，每個視野中精子數(shù)在200以上。

1.2.4 冷凍-解凍后精子質(zhì)膜完整率的測定 采用SYBR-14/PI雙熒光染色法對精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行檢測。SYBR-14是膜通透的核酸染料，能快速穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入活精子后與核酸結(jié)合發(fā)綠色熒光，而PI是一種膜不通透的核酸染料，它只能與死精子的核酸結(jié)合而發(fā)出紅色熒光。取解凍后精液100 μL置于離心管中，加入0.1 μL SYBR-14工作液混合均勻后置于37℃恒溫水浴鍋孵育10 min。然后再加入0.5 μL的PI工作液，混合均勻后置于37℃水浴鍋孵育10 min。孵育結(jié)束后置于熒光顯微鏡下檢測。綠色熒光表示精子頭部質(zhì)膜完整，紅色熒光殘缺或無熒光表示精子頭部質(zhì)膜受損。

1.2.5 冷凍-解凍后精子頂體完整率的測定 采用異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記的花生凝集素（FITC-PNA）染色法檢測。取精液50 μL均勻涂抹于載玻片，自然風(fēng)干。風(fēng)干后使用無水甲醇固定10 min并風(fēng)干。取30 μL FITCPNA染液覆蓋樣品，置于37℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后用PBS沖洗2～3次，自然風(fēng)干，無色指甲油封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 冷凍-解凍后精液中ROS、MDA含量的測定 使用ROS和丙二醛（MDA）試劑盒分別檢測解凍后精液中的ROS和MDA含量。

1.2.7 冷凍-解凍后精子ATP含量測定 采用ATP檢測試劑盒對精子ATP含量進(jìn)行測定。檢測原理是ATP能夠為螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）催化熒光素產(chǎn)生熒光提供能量。在螢火蟲熒光素酶和熒光素都過量的條件下，一定的濃度范圍內(nèi)ATP濃度與體系中產(chǎn)生熒光的強度具有線性關(guān)系，因此反應(yīng)后可通過熒光酶標(biāo)儀讀取檢測體系的熒光強度，進(jìn)一步計算體系中ATP含量。

1.2.8 冷凍-解凍后精子內(nèi)線粒體膜電位（MMP）測定 采用線粒體膜電位檢測試劑盒（熒光探針JC-1）對精子內(nèi)線粒體膜電位進(jìn)行檢測。JC-1是一種能夠在線粒體內(nèi)聚集的新型陽離子羰花青熒光染料，具有較高的膜通透性，能夠通過精子的質(zhì)膜與線粒體外膜而與線粒體內(nèi)膜特異性結(jié)合。當(dāng)線粒體內(nèi)膜內(nèi)外兩側(cè)電位差較大時，JC-1會發(fā)生聚集，形成聚合體而發(fā)出紅色熒光，當(dāng)細(xì)胞開始凋亡，細(xì)胞中的線粒體膜電位開始降低，內(nèi)外兩側(cè)電位差較小時，JC-1無法聚集而發(fā)出綠色熒光。使用熒光酶標(biāo)儀對精子內(nèi)線粒體膜電位狀態(tài)進(jìn)行檢測，JC-1的單體與聚合體的激發(fā)與發(fā)射波長分別為490 nm/530 nm與525 nm/590 nm。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（LSD），<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對精子冷凍-解凍后活力的影響 由表1可知，解凍后對照組的精子活力低于其他各組（<0.05），50 μmol/L二甲雙胍組的精子活力高于其他各組（<0.05）。25 μmol/L二甲雙胍組（33.03%）與100 μmol/L二甲雙胍組（35.54%）無顯著差異。

2.2 二甲雙胍對精子冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率的影響由表1可知，解凍后對照組的精子質(zhì)膜完整率（39.59%）低于其他各組（<0.05），50 μmol/L二甲雙胍組的精子質(zhì)膜完整率最高（52.99%）（<0.05）。25 μmol/L二甲雙胍組（45.70%）與100 μmol/L二甲雙胍組（45.98%）無顯著差異。

2.3 二甲雙胍對精子冷凍-解凍后頂體完整率的影響由表1可知，解凍后50 μmol/L二甲雙胍組（54.91%）的頂體完整率最高（<0.05）。對照組（39.81%）、25 μmol/L二甲雙胍組（44.73%）、100 μmol/L二甲雙胍組（44.02%）組間均無顯著差異。

表1 不同濃度二甲雙胍對精子冷凍-解凍后活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率的影響 %

2.4 二甲雙胍對精子冷凍-解凍后ROS的影響 由表2可知，50 μmol/L二甲雙胍組冷凍-解凍后精液中ROS水平（270.77 U/mL）低于其他各組（<0.05），對照組的ROS水平（462.11 U/mL）最高（<0.05）。25 μmol/L二甲雙胍組（392.01 U/mL）與100 μmol/L二甲雙胍組（358.77 U/mL）無顯著差異。

表2 不同濃度二甲雙胍對冷凍-解凍后精液中ROS、MDA、ATP、MMP的影響

2.5 二甲雙胍對精子冷凍-解凍后MDA的影響 由表2可知，50 μmol/L二甲雙胍組冷凍-解凍后精液中MDA水平低于其他各組（<0.05），而對照組最高（<0.05）。25 μmol/L二甲雙胍組（7.03 nmol/L）與100 μmol/L二甲雙胍組（6.62 nmol/L）無顯著差異。

2.6 二甲雙胍對精子冷凍-解凍后ATP的影響 由表2可知，精子冷凍-解凍后ATP水平由高到低為50 μmol/L二甲雙胍組>100 μmol/L二甲雙胍組>25 μmol/L二甲雙胍組>對照組（<0.05）。

2.7 二甲雙胍對精子冷凍解凍后MMP 的影響 由表2可知，添加二甲雙胍的試驗組中高線粒體膜電位的精子比率高于對照組（<0.05）。50 μmol/L二甲雙胍組的高線粒體膜電位的精子比率最高，且顯著高于其他兩個試驗組。25 μmol/L二甲雙胍組的MMP顯著低于100 μmol/L二甲雙胍組。

3 討 論

在犬精液冷凍保存過程中，造成精液品質(zhì)下降的最主要因素之一是冷凍保存過程中累積的ROS與精子膜中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞精子膜的結(jié)構(gòu)與功能完整性，使精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率降低。而精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率是評估精子受精能力的重要指標(biāo)，精子質(zhì)膜和頂體的完整可以確保精子與卵細(xì)胞透明帶中的特異性蛋白結(jié)合以發(fā)生精卵結(jié)合。本實驗結(jié)果顯示，在犬精液冷凍稀釋液中添加50 μmol/L二甲雙胍，冷凍-解凍后精子活力、質(zhì)膜完整率及頂體完整率分別為42.62%、52.99%和54.91%，與對照組相比顯著提高。Nguyen等研究結(jié)果顯示，將1 mmol/L二甲雙胍加入到雞精液冷凍稀釋液，可以顯著提升冷凍-解凍后精液品質(zhì)，精子活力達(dá)到58.8%，這與本試驗的結(jié)果相似。二甲雙胍的添加量不同可能是由于不同物種精子的最適環(huán)境滲透壓不同。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)二甲雙胍濃度為50 μmol/L時，精液冷凍-解凍后的保存效果最佳，而當(dāng)二甲雙胍濃度高于該濃度時精液品質(zhì)反而有所降低，這可能是因為高濃度二甲雙胍使精子處于一種高滲透壓溶液中，精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和完整性受到破壞與損傷，從而對精液品質(zhì)造成一定負(fù)面影響。

ROS為細(xì)胞內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物，然而當(dāng)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)受損時，ROS含量將大幅度增加并對細(xì)胞造成一定程度的損傷。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度越高，則MDA含量越高。因此通過檢測冷凍-解凍后犬精液中ROS和MDA含量可知二甲雙胍對犬精液抗氧化能力的影響。本研究結(jié)果顯示，犬精液冷凍稀釋液中加入二甲雙胍可以顯著降低冷凍-解凍后精液中MDA和ROS含量，提升精子的總抗氧化能力，當(dāng)二甲雙胍添加量為50 μmol/L時，MDA和ROS的含量處于最低狀態(tài)。與楊雄發(fā)現(xiàn)的二甲雙胍能夠有效阻止細(xì)胞中MDA水平的增加和SOD活性的下降這一結(jié)果相似。這可能是因為一方面二甲雙胍能夠減少細(xì)胞中3-磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）的表達(dá)以降低精子膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激；另一方面二甲雙胍能夠改善精子細(xì)胞的抗凍抵抗，間接減少氧化應(yīng)激，恢復(fù)精子細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激儲備。

線粒體膜電位是線粒體生產(chǎn)ATP的直接驅(qū)動力，正常細(xì)胞中線粒體的膜電位處于較高狀態(tài)，而線粒體膜電位較低時，說明細(xì)胞很可能發(fā)生凋亡。已有研究報道二甲雙胍能夠保護(hù)并維持線粒體的正常功能。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍的添加有利于保持精子高線粒體膜電位，50 μmol/L二甲雙胍濃度時，精子處于高線粒體膜電位的狀態(tài)最多。精子活力的維持需要大量能量的支持，作為最重要的能量分子，ATP在精子的各種生理、生化進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，精子內(nèi)ATP含量也一定程度上代表了精子能量代謝的活性。本研究結(jié)果表明，二甲雙胍的添加有利于精子ATP的維持，二甲雙胍添加組的ATP含量均顯著高于對照組。

4 結(jié) 論

本研究顯示，犬精液冷凍稀釋液中二甲雙胍的添加可有效提高冷凍-解凍后的精液品質(zhì)，50 μmol/L的二甲雙胍能顯著提高精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率，同時對提高冷凍-解凍后犬精液的抗氧化能力及能量代謝都有顯著效果。