姜 釗,張衛(wèi)花*

(1.藏藥檢測(cè)技術(shù)教育部工程研究中心,陜西 咸陽(yáng) 712082;2.西藏民族大學(xué) 西藏高原相關(guān)疾病分子遺傳機(jī)制與干預(yù)研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 咸陽(yáng) 712082)

復(fù)雜的海洋環(huán)境造就了海洋微生物的多樣性。海洋微生物包括細(xì)菌域、古菌域、真菌域以及病毒等各個(gè)類(lèi)群,估計(jì)物種超過(guò)2億種,生物碳總量達(dá)到9 000萬(wàn)t[1],僅沉積環(huán)境原核微生物就達(dá)到1030個(gè)細(xì)胞[2]。與其極端環(huán)境相適應(yīng)的生理特征和代謝機(jī)制,是生命起源與演化研究的重要基礎(chǔ)。因此,海洋微生物的純培養(yǎng)分離和功能探索十分迫切。

數(shù)據(jù)顯示,被描述的海洋來(lái)源微生物物種只占全球全部已描述微生物的9.7%,增加速率每年僅為0.93%,在細(xì)菌域100多個(gè)門(mén)中,70多個(gè)處于未培養(yǎng)狀態(tài),大多數(shù)微生物還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的純培養(yǎng)[3-4],而實(shí)驗(yàn)室的研究條件是這些微生物能否被培養(yǎng)的決定因素。自19世紀(jì)科赫(Koch)創(chuàng)立微生物純培養(yǎng)技術(shù)以來(lái)[5],科學(xué)家們不斷探索和設(shè)計(jì)純培養(yǎng)的分離培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)了一系列諸如真菌、乳酸菌、放線(xiàn)菌分離的選擇培養(yǎng)基[6-8],然而,同一份環(huán)境樣品中可培養(yǎng)微生物的多樣性和出菌率不僅受分離培養(yǎng)基的影響,也與樣品分離時(shí)的預(yù)處理方法息息相關(guān)[9]。SCHUT等[10]研究發(fā)現(xiàn),將樣品進(jìn)行稀釋后可使寡營(yíng)養(yǎng)微生物不受少數(shù)優(yōu)勢(shì)類(lèi)群競(jìng)爭(zhēng)作用的干擾,從而使其被培養(yǎng)的可能性提高;新鮮濕樣經(jīng)過(guò)自然風(fēng)干再稀釋后,進(jìn)行瞬時(shí)濕熱處理,適合放線(xiàn)菌類(lèi)群的分離培養(yǎng)[11];用不同的輻射方法處理樣品懸液,能提高部分類(lèi)群的培養(yǎng)率,如紫外線(xiàn)輻射能夠有效地分離Nocardiopsis、Nocardia和Pseudonocardiaspp.[12];利用原位富集-擴(kuò)散盒培養(yǎng)法及微囊包埋技術(shù)能較大程度地模擬微生物所處的自然環(huán)境,提高微生物可培養(yǎng)性[13-14];添加海鹽可以模擬天然海水條件,適合海洋菌的分離[15];部分抑制劑的添加可以抑制某類(lèi)微生物的生長(zhǎng),從而降低競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)[15]。隨著分離方法的不斷探索,實(shí)驗(yàn)中也將多種預(yù)處理方法結(jié)合使用,然而不同實(shí)驗(yàn)因素在實(shí)驗(yàn)中存在交互作用,很難找到每個(gè)因素的最佳實(shí)驗(yàn)水平。因此需進(jìn)一步優(yōu)化組合預(yù)處理方法,獲得更好的分離效果。

Box-Behnken方法又稱(chēng)響應(yīng)面法(Response Surface Method,RSM),是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二維及三維圖形展示,利用響應(yīng)面分析(Response Surface Analysis,RSA)確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)參數(shù),采用多元二次回歸方程及方差分析擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種多因素、多水平的優(yōu)化方法[16],可利用圖形分析、函數(shù)求導(dǎo)等手段來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最佳條件。本文利用響應(yīng)面優(yōu)化的方法針對(duì)采自印度洋深海沉積物中的1個(gè)樣品進(jìn)行該樣品純培養(yǎng)放線(xiàn)菌分離條件優(yōu)化,從而摸索出最佳的分離條件,以期達(dá)到最大程度分離出放線(xiàn)菌的目的,為后續(xù)大批樣本純培養(yǎng)放線(xiàn)菌的分離提供指導(dǎo)。

1 材料及培養(yǎng)基

1.1 樣品來(lái)源

實(shí)驗(yàn)樣品選自中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所印度洋調(diào)查航次(2013年)采集的12個(gè)海洋沉積物樣品之一,樣品采集后用無(wú)菌袋包裝,于4℃冰庫(kù)保存。根據(jù)采樣深度,選取深度為中等深度、編號(hào)為17號(hào)的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn),該樣品取樣位置為(89°7′42″E,9°15′43″N),取樣深度為3 437 m。

1.2 分離培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)基選用改良ISP2培養(yǎng)基:酵母粉4 g、葡萄糖4 g、麥芽粉4 g、復(fù)合維生素1 m L(維生素B1、維生素B2、煙酸、維生素B、泛酸鈣、肌醇、對(duì)氨基苯甲酸0.5 g、維生素H 0.25 g)、瓊脂15 g,根據(jù)優(yōu)化設(shè)計(jì)添加不同百分比的海鹽及不同濃度的抑制劑,雙蒸水定容至1 L,p H調(diào)至7.2,121℃滅菌30 min。菌株純化培養(yǎng)基為T(mén)SA培養(yǎng)基,121℃滅菌30 min。

2 優(yōu)化設(shè)計(jì)及菌株分離鑒定

2.1 菌株分離方法

樣品分離采用經(jīng)典的熱處理方法[11]:①在無(wú)菌條件下取1 g樣品,按優(yōu)化設(shè)計(jì)時(shí)間放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中風(fēng)干;②將風(fēng)干樣品置于有10 m L 0.8%生理鹽水的無(wú)菌試管中稀釋至0.1 g/m L,在室溫振蕩器中以170 r/min的速度震蕩1 h;③按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)利用水浴鍋進(jìn)行濕熱處理;④濕熱處理后的樣品梯度稀釋至0.001 g/m L,吸取100μL樣品稀釋液涂布于含改良ISP2分離培養(yǎng)基的平板上(分離培養(yǎng)基中按照優(yōu)化設(shè)計(jì)加入不同濃度的抑制劑和不同體積比海鹽),每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù),涂布完成后,分離平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個(gè)月;⑤培養(yǎng)完成后,將各實(shí)驗(yàn)組平板生長(zhǎng)菌落進(jìn)行劃線(xiàn)分離,純化培養(yǎng)并收集菌體。

2.2 菌株鑒定

利用酶解法提取各菌株基因組DNA[17],采用16S r RNA基因的通用引物[18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PA:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′;PB:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系:10×Buffer(Mg2+2.5 mmol/L)5μL,正向引物PA(0.25μmol/L)1 μL,反向引物PB(0.25μmol/L)1μL,d NTP 1μL,DNA 1μL,Taq DNA聚合酶0.3 U,用dd H2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min;95℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),用λ-Eco T14 Idigest DNA Marker作為對(duì)照,產(chǎn)物檢測(cè)回收后送昆明泊尚生物有限公司進(jìn)行雙端測(cè)序。測(cè)序完成的16S r RNA序列利用序列拼接軟件DNAstar[19]對(duì)正反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,之后用原核微生物比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud(http:∥eztaxon-e.ezbiocloud.net/)中的BLAST功能[20]進(jìn)行16S rRNA序列相似性分析,確定分離菌株的細(xì)菌分類(lèi)學(xué)位置,統(tǒng)計(jì)每組實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的不同微生物種類(lèi)數(shù)(Operational Taxonomic Units,OTU)作為響應(yīng)面優(yōu)化的響應(yīng)值,OTU以16S rRNA相似性98%為閾值[21],比對(duì)大于98%的菌株合并為1個(gè)種。

2.3 優(yōu)化因素選擇及優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.3.1 優(yōu)化因素及水平選擇

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中主要選取熱處理溫度(A)、熱處理時(shí)間(B)、抑制劑濃度倍數(shù)(C)、海鹽添加量(D)和樣品風(fēng)干時(shí)間(E)五個(gè)因素,經(jīng)前期單因素實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素篩選低、中、高三個(gè)水平設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中抑制劑1倍濃度組合為50 mg/L制霉菌素及25 mg/L萘啶酮酸,實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

2.3.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)中心組合原理,基于選取的5因素3水平,利用Minitab 16軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)[22],根據(jù)每組實(shí)驗(yàn)5因素的不同水平搭配展開(kāi)分菌實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分離平板于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1月后,利用劃線(xiàn)分離法進(jìn)行純化,純化菌株收取菌體后提取DNA,再進(jìn)行16S r RNA基因測(cè)序鑒定。序列拼接結(jié)果經(jīng)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)相似性比對(duì)分析后,計(jì)算每個(gè)平板的微生物種類(lèi)數(shù),最終以每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)平板鑒定的微生物種類(lèi)數(shù)(OTU)的平均值作為該組實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值。

3 結(jié) 果

3.1 菌株分離結(jié)果

經(jīng)純化、測(cè)序分析后,本次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共分離得到17個(gè)不同物種(species):其中14個(gè)種分布于放線(xiàn)菌門(mén)下的3個(gè)目、4個(gè)科,分別為迪茨氏菌科(Dietziaceae)3個(gè)種、微桿菌科(Microbacteriaceae)7個(gè)種、微球菌科(Micrococcaceae)1個(gè)種和諾卡氏菌科(Nocardiaceae)3個(gè)種;另外3個(gè)種分布于厚壁菌門(mén),其中芽孢桿科(Bacillaceae)2個(gè)種、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)1個(gè)種。同時(shí),確定了每組優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最終培養(yǎng)出的放線(xiàn)菌種類(lèi)數(shù)(表2),優(yōu)化前利用ISP2培養(yǎng)基直接稀釋涂布的方法幾乎很難分離到放線(xiàn)菌,只能分離到芽孢桿菌、葡萄球菌、假單胞菌等少數(shù)細(xì)菌類(lèi)群,而優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后共分離到17個(gè)物種,個(gè)別組可分離純化到6種放線(xiàn)菌,優(yōu)化效果明顯。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of Box-Behnken experiments

續(xù)表

3.2 二次回歸擬合及方差分析

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化分析,得出估計(jì)回歸系數(shù)(表3)和方差分析(表4)結(jié)果,可以看出:一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2均表現(xiàn)為極顯著,交互作用BD表現(xiàn)為顯著,說(shuō)明各具體實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系,并且處理時(shí)間和海鹽添加量之間交互作用明顯。方差分析顯示(表4),失擬顯著性參數(shù)P=0.240＞0.05,說(shuō)明失擬不顯著,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)誤差很數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn),不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng),模型適當(dāng)。

表3 菌株的估計(jì)回歸系數(shù)Table 3 The estimated regression coefficients of bacteria strains

表4 方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 The analysis of variance and significance test

根據(jù)一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互作用的顯著性參數(shù)(P)用Minitab 16軟件進(jìn)行回歸擬合后得到未編碼回歸方程:

編碼回歸方程為:

式中Y為OTU數(shù)。

3.3 響應(yīng)面及RSA分析

為進(jìn)一步確定各因素之間的交互作用,同時(shí)找到最佳實(shí)驗(yàn)條件,利用響應(yīng)曲面圖分析熱處理溫度、熱處理時(shí)間、抑制劑濃度倍數(shù)、海鹽添加量和樣品風(fēng)干時(shí)間5個(gè)因素對(duì)細(xì)菌分離OUT數(shù)的影響情況(圖1)。由圖1可見(jiàn),每個(gè)三維圖形成較好曲面,說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響是非線(xiàn)性的,各因素?cái)M合良好,交互作用明顯,在曲面圖中也能直觀(guān)地了解到兩兩因素影響下的最佳響應(yīng)值。

圖1 響應(yīng)面立體分析圖Fig.1 Three-dimensional analysis of response surface

為進(jìn)一步確定最佳實(shí)驗(yàn)條件,結(jié)合響應(yīng)面圖和回歸方程,運(yùn)用Minitab16軟件中的RSA分析(響應(yīng)優(yōu)化圖)模塊擬合每個(gè)因素的最佳水平(圖2)。可以看出每個(gè)因子(列)對(duì)響應(yīng)或復(fù)合合意性的影響。優(yōu)化的最終結(jié)果為:濕熱處理溫度55℃、濕熱處理時(shí)間1.272 7 min、風(fēng)干時(shí)間1.697 0 d、抑制劑濃度倍數(shù)0.969 7倍、海鹽添加量為2.121 2%。在優(yōu)化條件搭配下可以培養(yǎng)出的微生物種類(lèi)數(shù),即可培養(yǎng)最大菌種數(shù)為5.680 3。整體優(yōu)化程度評(píng)估中,復(fù)合合意性(0.936 1)接近1,表明總體設(shè)置能夠獲得一個(gè)較好的響應(yīng)結(jié)果。

圖2 響應(yīng)優(yōu)化分析圖Fig.2 Analysis of response conditions optimization

3.4 優(yōu)化驗(yàn)證

為檢測(cè)RSA法分析的可靠性,利用優(yōu)化后的分離條件,分別選用4種分離培養(yǎng)基對(duì)該樣品進(jìn)行純培養(yǎng)放線(xiàn)菌菌株分離。放線(xiàn)菌分離培養(yǎng)基:酪蛋白胨1 g、天冬酰胺0.1 g、丙酸鈉4 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7 H2O 0.1 g、FeSO4·7 H2O 1 mg、甘油1 m L、瓊脂15 g、雙蒸水定容至1 L,p H調(diào)至7.2～7.4,121℃滅菌30 min;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:酪蛋白胨0.3 g、酵母提取物0.1 g、葡萄糖0.01 g、瓊脂15 g、雙蒸水定容至1 L,p H調(diào)至7.2～7.4,121℃滅菌30 min;海洋2216培養(yǎng)基:蛋白胨1 g、酵母提取物2 g、檸檬酸鐵0.1 g、Na2CO30.16 g、硅酸鈉4 mg、(NH4)NO31.6 mg、雙蒸水定容至1 L,p H調(diào)至7.2,121℃滅菌30 min;R2A培養(yǎng)基:酵母提取物0.5 g、眎蛋白胨0.5 g、酪氨酸0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、丙酮酸鈉0.3 g、K2HPO40.3 g、MgSO4·7 H2O 0.05 g、雙蒸水定容至1 L,p H調(diào)至7.2,121℃滅菌30 min。經(jīng)分離純化及測(cè)序鑒定,最終分離得到27個(gè)不同物種(表5)。分布于芽孢桿菌屬(Bacillus)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、成對(duì)桿菌屬(Dyadobacter)、赤桿菌屬(Erythrobacter)、花蕾桿菌屬(Gemmobacter)、兩面神菌屬(Janibacter)、小單孢菌屬(Microbacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、含鞘氨醇盒菌屬(Sphingopyxis)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)及劉志恒菌屬(Zhihengliuella),其中16S r RNA相似性在98%以下可能的潛在新分類(lèi)單元2個(gè)(表5)。相較于ISP2培養(yǎng)基,又新分離到成對(duì)桿菌屬、赤桿菌屬、花蕾桿菌屬、兩面神菌屬、小單孢菌屬、根瘤菌屬等多個(gè)菌屬,其中小單孢菌屬,鏈霉菌屬,含鞘氨醇盒菌屬都為海洋優(yōu)勢(shì)放線(xiàn)菌類(lèi)群。與張偲等[23]、Goodfellow和Fiedler[24]在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的放線(xiàn)菌屬類(lèi)群相比,成對(duì)桿菌屬、赤桿菌屬、花蕾桿菌屬、兩面神菌屬等在以前的海洋樣品中均較少被發(fā)現(xiàn),也間接反映了該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法的優(yōu)越性,同時(shí)說(shuō)明不同培養(yǎng)基的選擇在純培養(yǎng)分離中尤為重要。

表5 27個(gè)細(xì)菌物種16S r RNA基因序列BLAST比對(duì)結(jié)果Table 5 BLAST results of 16S r RNA gene sequences of 27 bacterial species

4 結(jié) 語(yǔ)

深海極端環(huán)境原核微生物的純培養(yǎng)一直以來(lái)都是個(gè)難題,其中放線(xiàn)菌的培養(yǎng)更艱難,分離的結(jié)果受到培養(yǎng)基以及預(yù)處理?xiàng)l件等多因素的影響。本文選取樣品風(fēng)干時(shí)間、濕熱處理溫度、濕熱處理時(shí)間、培養(yǎng)基中抑制劑濃度倍數(shù)、培養(yǎng)基中海鹽添加量五個(gè)因素,根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)每個(gè)因素各取低、中、高三個(gè)水平,利用Minitab軟件中的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),并以每組實(shí)驗(yàn)分離的菌株數(shù)為該組實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)回歸及方差分析,得到回歸方程,之后利用響應(yīng)曲面及RSA分析得到每個(gè)因素的最優(yōu)水平:濕熱處理溫度55℃、濕熱處理時(shí)間1.272 7 min、風(fēng)干時(shí)間1.697 d、抑制劑濃度倍數(shù)0.969 7倍、海鹽添加量為2.121 2%。最后,選取4種培養(yǎng)基進(jìn)行菌種分離驗(yàn)證,最終得到27個(gè)不同物種,2個(gè)潛在新分類(lèi)單元,在分離菌株中有鏈霉菌屬,小單胞菌屬等海洋優(yōu)勢(shì)菌群,還有部分前期未曾分到的稀有菌屬,如成對(duì)桿菌屬、赤桿菌屬、花蕾桿菌屬和兩面神菌屬等。實(shí)驗(yàn)證明,分離條件的優(yōu)化有利于可培養(yǎng)微生物的多樣性和出菌率的提高。該分菌條件的確定為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)采自印度洋樣點(diǎn)其他樣品的可培養(yǎng)放線(xiàn)菌的多樣性分析提供了保證,同時(shí)也為微生物純培養(yǎng)預(yù)處理方法的優(yōu)化奠定了一定的基礎(chǔ)。