郭霞 田永攀 劉海軍 趙宇 徐平

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

博爾納病病毒(borna disease virus，BDV) 是一種系統(tǒng)遺傳多樣性、未分段、有包膜的單分子負(fù)鏈RNA嗜神經(jīng)病毒，可持續(xù)感染宿主[1-2]。最新研究報(bào)道，BDV-1感染是器官移植后人類死亡的原因之一[3]，當(dāng)宿主受到BDV抗原侵襲后會(huì)發(fā)生一系列免疫反應(yīng)，引起多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如免疫介導(dǎo)的吉蘭—巴雷綜合征(guillain-barre syndrome,GBS)、腦脊髓炎以及非炎癥性行為改變等[4-5]。本研究主要探討貴州省部分地區(qū)GBS患者BDV感染情況，以及同組病人不同標(biāo)本博爾納病病毒循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complexes,CIC)及抗體陽性率差異。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 本研究經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有參與者獲得知情同意。采集貴州省部分地區(qū)9例GBS患者的血液及腦脊液(男4例，女5例)，對(duì)照組93例血漿來自遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢科；對(duì)照組45例腦脊液來自遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科及腦血管科神經(jīng)系統(tǒng)非炎性疾病(如腦外傷)患者。抗體和陽性(E4278)、陰性(LWJ)對(duì)照的樣本由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病研究所提供，分別是抗P40的單克隆抗體Wl和抗P24的單克隆抗體Kfu2病毒液。

1.2標(biāo)本處理 分別采集實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組每個(gè)患者腦脊液各3～4 mL及血液各5～8 mL，離心后分別分裝在200 μL離心管，-80℃冰箱保存。

1.3腦脊液BDV-CIC檢測(cè) 包被鼠抗IgG，以包被液稀釋成 1 μL/mL 溶液，37℃反應(yīng)1 h，包被BDV P24及BDV P40各20 μL，以樣本緩沖液稀釋成 4 μL/mL 溶液，4 ℃冰箱過夜，洗板后加入腦脊液(100 μL/孔)，設(shè)置陰性及陽性對(duì)照，37℃反應(yīng) 1 h，洗滌后加入羊抗人 IgG 溶液于37 ℃反應(yīng)1 h，洗滌后加入顯色劑(計(jì)時(shí)3 min)，再加入50 μL的終止液，最后在 405 nm分光光度計(jì)讀取3次，取平均值。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：OD405 nm值≤0.1，陰性；在0.1～0.12之間，臨界值；在0.12～0.15之間，弱陽性(-+)；在0.15～0.3之間，陽性(+)；在0.3～0.6之間，中度陽性(++)；在0.6～1.0之間，強(qiáng)陽性(+++)；>1.0，極強(qiáng)陽性(++++)。

1.4BDV特異性抗體的檢測(cè) 加樣取240 μL被感染的OL細(xì)胞(病毒液)加入12 mL的樣本緩沖液中(稀釋液比例1∶50)，加入96孔板，除空白對(duì)照不加，其余孔各加入100 μL，37℃反應(yīng)1 h，洗滌后取20 μL的CSF與180 μL的樣本緩沖劑混勻，除空白對(duì)照不加，其余孔各加入 100 μL，37 ℃反應(yīng) 1 h。余下步驟及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)同腦脊液CIC。

1.5血液BDV-CIC檢測(cè) 檢測(cè)步驟及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)同腦脊液CIC。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

表1 兩組腦脊液、血漿中BDV-CIC檢出率及血漿中抗體檢出率的比較(n,%)

3 討 論

吉蘭—巴雷綜合征即急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy，AIDP)是一種病因未明的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病，約65%的GBS患者起病前1～4周有呼吸道或者胃腸道的感染癥狀。研究[6]指出，GBS的發(fā)病機(jī)制是感染后引起的異常免疫應(yīng)答，引起疾病爆發(fā)較常見誘因有細(xì)菌、病毒感染，疫苗接種史，乙型肝炎表面的免疫復(fù)合物也可能與GBS的病因及慢性復(fù)發(fā)性多發(fā)性神經(jīng)病相關(guān)。近年來，有學(xué)者針對(duì)我國(guó)BDV感染引起GBS進(jìn)行臨床研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其目的基因片段為BDV高度保守序列，經(jīng)臨床測(cè)序后證實(shí)與BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株的相應(yīng)序列具有明顯的同源性。在早期研究中Bode等在92例周圍神經(jīng)病外周血中行qRT-PCR檢測(cè)出4例BDV-P40抗體；隨后徐平[7]等用nRT-PCR在慢性GBS病患者中發(fā)現(xiàn)了BDV-p24陽性基因片段，經(jīng)測(cè)序后證實(shí)與BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株的相對(duì)應(yīng)序列具有明顯的同源性，表明周圍神經(jīng)系統(tǒng)和血液、骨髓中等肺腎經(jīng)細(xì)胞也是BDV的復(fù)制部位；魏志杰[8]等用Western blot法在19例GBS患者中檢測(cè)出1例BDV-p24抗體，陽性率高于健康對(duì)照組。金興振[9]等用Western blot法在19例GBS患者中檢測(cè)處1例BDV-p40抗體，陽性率高于健康對(duì)照組。本次研究中，GBS患者組腦脊液中BDV-CIC檢出率為11.10%，高于對(duì)照組的BDV-CIC檢出率，GBS患者組血漿中BDV-CIC及抗體檢出率為33.3%，高于健康對(duì)照組的BDV-CIC檢出率。3例陽性患者中有2例是以四肢麻木、乏力為主要表現(xiàn)，1例以四肢進(jìn)行性麻木伴口角歪斜半月入院，入院后行腦脊液檢查細(xì)胞數(shù)、糖、氯化物無明顯異常，可見明顯蛋白-細(xì)胞分離現(xiàn)象，為臨床確診GBS病例，本研究進(jìn)一步證實(shí)了貴州省部分地區(qū)人群GBS患者中存在BDV的感染。

近年來，我國(guó)部分地區(qū)的對(duì)BDV感染后引起異常免疫應(yīng)答相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病報(bào)道較多，如腦炎、帕金森病等[10-12]，但關(guān)于BDV感染引起GBS的有效病例國(guó)內(nèi)外報(bào)道均較少，且陽性檢出率低，吳偉[13]等使用nRT-PCR和qRT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)10例已確診為GBS患者血漿，未檢測(cè)出BDV p24 基因片段。主要是因?yàn)榇祟惣膊∪巳喊l(fā)病率普遍較其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病低，且目前實(shí)驗(yàn)室檢查方法多樣化，既往檢測(cè)BDV感染的常用方法是FQ-nRT-PCR法和Wester blot法，具有操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、漏診率高、檢出率低等缺點(diǎn)。本次研究主要采用Hanns Ludwig和Liv Bode及其研究團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)的一個(gè)突破性的BDV檢測(cè)方法即新型三聯(lián)ELISA法，其檢測(cè)GBS患者BDV-CIC屬于特異CIC[14]。該方法主要優(yōu)點(diǎn)為：同時(shí)檢測(cè)BDV P24、P40兩種特異性的CIC，對(duì)比以前檢測(cè)其中一種特異性的指標(biāo)(P24或者P40)，較大的提高其特異性、敏感性，簡(jiǎn)便性、快捷性，以及重復(fù)性好，且常規(guī)應(yīng)用試驗(yàn)前不需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行加熱滅活或特殊的吸收處理等優(yōu)點(diǎn)，并能夠快速而準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)整個(gè)感染過程，為預(yù)防和治療提供可靠的依據(jù)[15]。

本次研究結(jié)果顯示，GBS患者血漿外周血單核細(xì)胞BDV-CIC檢測(cè)陽性率33.33%(3/9)，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。說明BDV特異性CIC穩(wěn)定性較高，當(dāng)宿主感染BDV后，會(huì)產(chǎn)生特異性的BDV抗體，隨著感染的時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致BDV抗原不斷釋放到血液，產(chǎn)生抗體，繼而抗原抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致標(biāo)本中存在的BDV抗原、抗體數(shù)量相應(yīng)減少。BDV抗原的存在表明宿主處于急性感染期，檢出率較低；BDV抗體的存在，表明宿主處于繼發(fā)感染，而BDV-CIC的存在，提示持續(xù)感染，所以CIC檢測(cè)不僅比一般的檢測(cè)敏感性高，且在患者感染的每個(gè)時(shí)期均可被檢查到。而同時(shí)進(jìn)行的腦脊液BDV-CIC檢測(cè)陽性率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因可能是：(1)為更好對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加大血漿樣本量致100 μL/孔，這可能是血漿中BDV-CIC檢出率高于腦脊液的原因。(2)BDV主要通過鼻口黏膜的分泌物、血液、垂直等途徑傳播[16-17]，故感染途徑及器官易感性不同。(3)不同發(fā)病時(shí)期所檢測(cè)陽性率不同，同一標(biāo)本腦脊液或者血液收集時(shí)間及對(duì)其處理不一樣。(4)BDV特異性CIC的分子量一般較大，難以通過血腦屏障。因此血漿中BDV特異性CIC檢測(cè)其敏感性、特異性高，易于操作，簡(jiǎn)單易行，并可監(jiān)測(cè)感染以及治療整個(gè)過程。

本研究顯示腦脊液和外周血BDV抗體檢測(cè)陽性率實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GBS患者腰穿大多在病毒感染后2周左右，可能是因?yàn)榛颊咭呀?jīng)處于病毒攜帶狀態(tài)或者恢復(fù)期[18]，在感染早期，抗原抗體表達(dá)較高，兩者結(jié)合形成特異性CIC，由于不斷形成CIC，抗原抗體減少。國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)提示循環(huán)免疫復(fù)合物檢出率是抗體檢出率的10倍，與本次研究符合。

近年來隨著研究不斷深入，已證實(shí)BDV與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在相關(guān)性，如得不到有效治療，可能引發(fā)爆發(fā)流行，局面難以控制，故臨床出現(xiàn)原因不明，診斷不清時(shí)，應(yīng)想到是否BDV感染所致。就目前研究來看BDV與GBS具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道少。BDV感染的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離，但病毒分離復(fù)雜且敏感性低，BDV為非容細(xì)胞性感染，不易分離[19]。因此在今后的研究中利用新型三聯(lián)Elisa檢查來進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，收集更多臨床資料及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，為臨床的診斷及指導(dǎo)治療提供更有力的依據(jù)。