李亞明，張智峰，劉 霞

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,河南 鄭州450052；2.徐州市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇 徐州221600)

當前，惡性腫瘤已躍居危害人類健康疾病的榜首，很多腫瘤患者就診時已處于中晚期，手術(shù)加放化療是治療首選，如何減弱化療藥物的不良反應，提高患者以后生存質(zhì)量是亟待解決的重點，前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)華蟾素(Cinobufacin)聯(lián)合阿霉素(Dox)對腦膠質(zhì)瘤治療具有可行性，兩者聯(lián)合可提高腦膠質(zhì)瘤U251細胞p21WAF1、p27、Bax蛋白的表達，加速腦膠質(zhì)瘤U251細胞的凋亡。華蟾素不僅可直接作用腫瘤細胞，還可提高阿霉素對腦膠質(zhì)瘤U251細胞的敏感性及抗腫瘤的效用，且減弱阿霉素的不良反應。華蟾素聯(lián)合阿霉素作用腦膠質(zhì)瘤U251細胞對其增殖和體外侵襲能力影響如何？本實驗繼續(xù)深入研究。腫瘤患者死亡的最主要因素之一是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移導致的，樁蛋白(Paxillin)基因是致瘤性酪氨酸激酶的一種底物，具有調(diào)節(jié)細胞移動和播散等功能，進而能夠提高腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的能力[1-2]。多項研究報道Paxillin參與動態(tài)調(diào)節(jié)黏著斑、是一種重要的細胞黏附因子，可調(diào)節(jié)細胞的移動、誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化和播散[3-5]。腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移和預后與細胞的黏附力、移動力的改變密切相關(guān)，這提示Paxillin在腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[6-8]。本研究探討華蟾素聯(lián)合阿霉素能否降低Paxillin基因在腦膠質(zhì)瘤U251細胞中的表達，以觀察Paxillin基因表達下調(diào)后腦膠質(zhì)瘤U251細胞體外侵襲能力的變化，同時檢測各個作用組腦膠質(zhì)瘤U251細胞中局部黏附斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)及基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metallo proteinases-2,MMP-2)基因、蛋白的表達水平的差異，為腦膠質(zhì)細胞瘤侵襲機制的研究提供新的思路，并為其臨床分子靶向治療提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 腦膠質(zhì)瘤U251細胞株由鄭州大學病理教研室提供，培養(yǎng)在含RPMI-1640的培養(yǎng)液中(37 ℃、5% CO2、10%胎牛血清，100 mg/ml鏈霉素、青霉素)常規(guī)傳代觀察培養(yǎng)。阿霉素和華蟾素注射粉劑(R034347-25，Z34020273)、胎牛血清、RPMI-1640、ECL顯色試劑盒、 兔抗人Paxillin、FAK和MMP-2抗體均購自美國Santa Cruz公司

1.2 實驗方法

1.2.1 各組細胞組織形態(tài)觀察：先用胰酶消化處理腦膠質(zhì)瘤U251細胞成3×104/ml的單細胞懸液，再分成四組，均接種在96孔板上。阿霉素組：每孔依次滴加0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 ng/ml的阿霉素(各濃度均設(shè)6個復孔)；華蟾素組：每孔依次滴加5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/ml的華蟾素(各濃度均設(shè)6個復孔)；聯(lián)合組：每孔依次滴加0.10、0.50、2.00 ng/ml的阿霉素和 10.00 μg/ml的華蟾素(各濃度均設(shè)6個復孔)；對照組：每孔依次滴加上述分組同劑量的RPMI-1640培養(yǎng)液作用腦膠質(zhì)瘤U251細胞。將上述分組細胞置入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后棄上清液取出96孔板中的蓋玻片，放至倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況、形態(tài)學變化。

1.2.2 各組細胞增殖抑制率檢測：將分組的細胞培養(yǎng)24、48、72 h后加入MTT 20.00 μl(5.00 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止并棄掉上清液，加入DMSO 200 μl/孔振蕩搖勻10 min后上調(diào)節(jié)酶標儀檢測，計算波長570 nm(空白對照組調(diào)零)比色下的OD值，檢測藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)和細胞增殖抑制率。IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]3。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100% 。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)：按照Trizol試劑盒步驟提取各組總的RNA。先反轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA第一鏈后再行PCR反應(β-actin為內(nèi)參)，Paxillin(383 bp) mRNA引物序列為F：5’-TGAAACTGGAACCCTTGTCC-3’，R：5’ TATGCTGGCA TTGTCTGGAG-3’；FAK(498 bp) mRNA引物序列為F：5’-TCCTAATGTTGATGCCTGCC-3’，R:5’-CCTTGAAAAGGCTTCACACC-3；MMP-2 (607 bp) mRNA引物序列為F：5’-ATCCAGACTTCCTC AGGCG-3’，R：5’-GTAGTTGGCCACATCTGGGT-3’；β-actin(170 bp) mRNA引物序列為，F(xiàn)：5’AAATCTGGCACCACACCTT-3’，R：5’-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3’。按照RT-PCR試劑盒說明逐步操作，PCR反應條件和步驟：96 ℃預變性6 min；96 ℃ 35 s，退火條件Paxillin (58 ℃、50 s)、FAK (58 ℃、48 s)、MMP-2 (60 ℃、 48 s)，三個基因在74 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)。取10 μl產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳成像后分析其條帶峰面積來反映Paxillin、FAK、MMP-2 中RNA表達的改變。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blotting)：收集提取各組細胞總蛋白量，用Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度后，取50 μg蛋白上樣量，通過8%、12% SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉后加入兔抗人Paxillin抗體(1∶300)、FAK抗體(1∶300)、MMP-2 抗體(1∶200)，放置4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜；隔日先用TBS洗膜(10 min×3次)，再加入羊抗兔二抗，繼續(xù)室溫微搖2 h，再次TBS洗膜(10 min×3次)；X線膠片曝光顯影，β-actin抗體作為內(nèi)參上樣對照，采用Gel-Doc圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值，反映Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表達變化。

1.2.5 侵襲小室(Boyden chamber)實驗：腦膠質(zhì)瘤U251細胞遷移、侵襲能力檢測采用Boyden chamber小室觀察分析。具體步驟如下：將各組細胞(每組大約105個細胞)懸浮在有0.2%的小牛血清的600 μl的培養(yǎng)液中，依次接種在Boyden小室的上層，培養(yǎng)6 h后收集遷移至濾膜下層的細胞，先用4%多聚甲醛固定后再用0.1%結(jié)晶紫染色(細胞“貼壁”面朝上，蓋載玻片)，放置顯微鏡下隨機計數(shù)濾膜下層的細胞個數(shù)，至少選取5個高倍(×400)視野內(nèi)的穿膜細胞數(shù)，計算平均值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 見表1。腦膠質(zhì)瘤U251細胞在不同濃度的阿霉素作用24、48、72 h后，各組細胞增殖抑制率對比差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)在阿霉素濃度0～2.00 ng/ml的范圍，腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖抑制率與其濃度無明顯相關(guān)性(r=0.227,P>0.05)。單用阿霉素干預腦膠質(zhì)瘤U251細胞24、48、72 h，IC50> 2.00 ng/ml，提示腦膠質(zhì)瘤U251細胞對阿霉素作用不敏感。故采用2.00 ng/ml阿霉素完成后續(xù)實驗；不同濃度的華蟾素干預腦膠質(zhì)瘤U251細胞24、48、72 h后，各組增殖率比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，相關(guān)分析顯示華蟾素濃度在0～25.00 μg/ml范圍，腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖抑制率與華蟾素濃度關(guān)系呈負相關(guān)(r=-0.735，P<0.05)，提示腦膠質(zhì)瘤U251細胞對華蟾素作用敏感，故選用10.00 μg/ml 華蟾素完成后續(xù)實驗；聯(lián)合組與其他各組比較，細胞增殖抑制率明顯加強且表現(xiàn)一定的劑量依賴性。

表1 四組干預不同時間腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖抑制率比較(%)

2.2 不同干預下腦膠質(zhì)瘤U251細胞形態(tài)變化差異 見圖1。未干預的腦膠質(zhì)瘤U251細胞光鏡下呈多邊形、少圓形、梭形狀貼壁生長，細胞膜邊緣光整，細胞間排列結(jié)構(gòu)緊密，易有核分裂，偶見壞死細胞，整個細胞多以彌漫均勻單層排列狀。而加入華蟾素組、阿霉素組、聯(lián)合組的細胞顯示：少數(shù)細胞胞膜皺縮，細胞變圓，間隙變寬，且單個細胞體積變小，形態(tài)狹長，細胞連接松散，核分裂和壞死細胞增多，整體細胞數(shù)量減少，以聯(lián)合組的效果最明顯，藥物組與對照組比較，細胞的生長活力均顯示不同程度地被抑制。

2.3 不同干預下腦膠質(zhì)瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 mRNA表達情況 見表2。選取2.00 ng/ml阿霉素與10.00 μg/ml 華蟾素聯(lián)合作用，結(jié)果顯示與對照組相比，阿霉素組、華蟾素組、聯(lián)合組Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表達量均顯著減少(均P<0.05)。聯(lián)合組與阿霉素組、華蟾素組的Paxillin、FAK、MMP-2表達量比較，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表2 不同干預下腦膠質(zhì)瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 mRNA表達

2.4 不同干預下腦膠質(zhì)瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 蛋白表達情況 見表3。選取2.00 ng/ml阿霉素與10.00 μg/ml 華蟾素聯(lián)合作用，結(jié)果顯示對照組相比，阿霉素組、華蟾素組、聯(lián)合組Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表達量均顯著減少(均P<0.05)。聯(lián)合組與阿霉素組、華蟾素組的Paxillin、FAK、MMP-2表達量比較，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

A:對照組;B:2.00 ng/ml 阿霉素組;C:10.00 μg/ml 華蟾素組;D:2.00 ng/ml 阿霉素+10.00 μg/ml華蟾素組

表3 不同干預下腦膠質(zhì)瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 蛋白表達

2.5 不同干預下腦膠質(zhì)瘤U251細胞侵襲能力差異 見表4(圖2)。各組作用48 h后，收取各組細胞，接種在小室的上層。選取2.00 ng/ml阿霉素與10.00 μg/ml華蟾素聯(lián)合作用，結(jié)果顯示與對照組比較，華蟾素組、阿霉素組及聯(lián)合組穿模細胞數(shù)均下降，聯(lián)合組的細胞的穿膜數(shù)下降最明顯(均P<0.05)，華蟾素組與阿霉素組相對比較顯示無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Boyden chamber結(jié)果提示，聯(lián)合組可以顯著抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞的侵襲、遷移能力。

表4 不同干預下腦膠質(zhì)瘤U251細胞的侵襲能力(%)

A:對照組;B:2.00 ng/ml 阿霉素組;C:10.00 μg/ml華蟾素組;D:2.00 g/ml阿霉素+10.00 μg/ml華蟾素組

3 討 論

最新發(fā)布的中國惡性腫瘤流行病學數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增長，嚴重危害人類健康和生活。目前，晚期惡性腫瘤的治療仍以手術(shù)治療為主，術(shù)后化學治療為輔，而化療藥物自身的不良反應，導致臨床治療效果不盡人意，且嚴重影響患者術(shù)后生活質(zhì)量。前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)華蟾素可以抑制腫瘤細胞，提升患者免疫功能，且與阿霉素聯(lián)合可通過提高腦膠質(zhì)瘤U251細胞p21WAF1、p27、Bax蛋白的表達，來增強腦膠質(zhì)瘤U251細胞的凋亡，提高阿霉素的療效[9-10]。阿霉素作為化療藥物在臨床治療中會產(chǎn)生不良反應，但研究已經(jīng)證實，合理恰當?shù)臐舛染哂锌鼓[瘤功效。華蟾素因其能抑制腫瘤細胞生長、鮮有不良反應已被臨床認可且推薦應用。四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)結(jié)果證實華蟾素和阿霉素具有交互作用，阿霉素可以抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖但效果不明顯，阿霉素與華蟾素聯(lián)合作用腦膠質(zhì)瘤U251細胞，對其增殖抑制作用優(yōu)于各單藥作用組，且與藥物濃度、干預時間呈現(xiàn)正相關(guān)性。前期實驗也證實了華蟾素與低劑量阿霉素聯(lián)合作用不僅提高阿霉素對腦膠質(zhì)瘤U251細胞的敏感性且降低了阿霉素自身的不良反應。阿霉素單藥作用對腦膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖抑制效應明顯弱于華蟾素單藥組。藥理機制可能是阿霉素對腦膠質(zhì)瘤U251細胞靈敏度低于華蟾素，因此本實驗為了增加阿霉素的敏感度同時減弱其不良反應，并且保持其現(xiàn)有的實驗效應，我們選用將阿霉素與華蟾素聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)其作用效應仍強于各單藥作用，推測阿霉素聯(lián)合華蟾素對腦膠質(zhì)瘤U251細胞的作用可能是通過調(diào)控某些相關(guān)的基因表達來發(fā)揮效應。Paxillin基因定位在人染色體12q24，是LIM家族蛋白成員，分布在黏著斑，更是重要的細胞黏附因子之一。它能夠與整合素關(guān)聯(lián)，可與BCR-AB2、v-Src、v-Crk等致瘤性蛋白結(jié)合，促使致瘤性酪氨酸激酶活化，是構(gòu)成細胞與細胞外基質(zhì)局部黏附的關(guān)鍵通路。Paxillin能調(diào)節(jié)細胞移動、散播，擾亂或誤導控制細胞增殖所需的生長因子信號級聯(lián)的傳遞，改變腫瘤細胞運動黏附的信號傳導，進而提高腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的能力[11-14]。目前許多研究[7，15]已證實，肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中Paxillin呈高表達，且高表達的Paxillin加強了腫瘤細胞與周圍非腫瘤細胞之間的局部黏附作用，使腫瘤細胞更易發(fā)生浸潤、遷移進而形成轉(zhuǎn)移。我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)細胞瘤中也存在Paxillin基因的高表達,且Paxillin的表達水平與腦膠質(zhì)細胞瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵襲性呈正相關(guān)。故本課題采用華蟾素聯(lián)合阿霉素作用腦膠質(zhì)瘤U251細胞，研究能否對細胞黏附相關(guān)蛋白FAK和與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因MMP-2表達產(chǎn)生作用進而影響Paxillin基因的表達來影響腦膠質(zhì)瘤U251細胞的侵襲轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinases，MMPs)是細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的重要蛋白水解酶，是降解人體內(nèi)細胞外基質(zhì)的主要酶類，對于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移突破物理屏障及促使腫瘤克隆增殖，加促新生血管的形成有重要意義[16-19]。MMPs是FAK信號傳導通路的下游分子，因其幾乎能降解細胞外基質(zhì)的所有成分而備受研究者青睞[20-21]。在本實驗中，我們首先將腦膠質(zhì)瘤U251細胞株消化處理成3×104/ml的懸液，分為四組。阿霉素組分別加入0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 ng/ml的阿霉素；華蟾素組依次滴加5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/ml濃度的華蟾素；聯(lián)合用藥組加入0.10、0.50、2.00 ng/ml的阿霉素和華蟾素 10.00 μg/ml；對照組替代加入同劑量RPMI-1640培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48、72 h。四甲基偶氮唑藍比色法檢測各組對腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖抑制的影響；并從中選出最優(yōu)聯(lián)合濃度進行探討；RT-PCR和Western blotting方法檢測在不同干預條件下細胞中Paxillin、FAK、MMP-2基因和蛋白的表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，華蟾素組、阿霉素組、華蟾素和阿霉素聯(lián)合組干預腦膠質(zhì)瘤U251細胞后，其Paxillin、FAK、MMP-2在mRNA表達水平和蛋白表達水平均明顯下降，華蟾素和阿霉素聯(lián)合組下降更顯著，提示Paxillin表達的下降能引起FAK、MMP-2表達的相應下降，其機制可能是因為MMP-2是FAK信號的下游靶基因，F(xiàn)AK表達水平的高低會直接影響MMP-2的表達，但三者之間是通過何種信號通路傳遞？如何彼此相互作用、相互影響是我們需要繼續(xù)深入研究的方向。華蟾素和阿霉素聯(lián)合組可以顯著下調(diào)Paxillin基因的表達，進而相應引起FAK、MMP-2 mRNA和蛋白水平的降低，那么Paxillin表達水平的降低是否會引起腦膠質(zhì)瘤U251細胞相應生物學行為發(fā)生改變呢？Boyden chamber小室體外侵襲實驗檢測華蟾素、阿霉素、華蟾素聯(lián)合阿霉素對腦膠質(zhì)瘤U251細胞侵襲、遷移能力的變化，結(jié)果顯示：與對照組相比，華蟾素、阿霉素單藥組、聯(lián)合組均可以引起穿膜細胞數(shù)明顯減少，聯(lián)合組穿膜細胞數(shù)減少更顯著，Paxillin基因表達的下降可能引起腦膠質(zhì)瘤U251細胞遷移能力的減弱，更進一步驗證華蟾素和阿霉素聯(lián)合具有可行性，兩者聯(lián)用通過抑制Paxillin基因的表達來阻止腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移增強抗腫瘤的作用。華蟾素不僅可以直接殺傷腫瘤細胞和減弱腫瘤侵襲力，還可聯(lián)合阿霉素產(chǎn)生協(xié)同效應，加強阿霉素對腫瘤細胞的敏感度，是較理想的化療藥物增效劑和保護劑。然而，為什么Paxillin基因表達的降低可以減弱腫瘤細胞的遷移能力，一方面這與FAK、MMP-2表達降低直接相關(guān)，還有無其它具體機制尚需進一步深入研究和探討。