戴瑞卿 賴寶春 吳振強 曾天寶 王家瑞

摘要 [目的]分析健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內古菌群落結構與多樣性。[方法]運用Illumina MiSeq高通量測序技術，分別對根際土壤、非根際土壤及根內古菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進行擴增并測序，分析健康與患根腐病草莓不同部位古細菌群落結構與多樣性。[結果]健康組共鑒定出11個門、19個綱、25個目、29個科、43個屬，患根腐病組共鑒定出11個門、20個綱、27個目、32個科、47個屬。門水平上，所有土壤樣品的優(yōu)勢古菌門均為奇古菌門（Thaumarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeota）和烏斯古菌門（Woesearchaeota），所有根內樣品優(yōu)勢菌門均為奇古菌門和廣古菌門;患根腐病草莓根際和非根際土壤的奇古菌門相對豐度均低于健康草莓，廣古菌門和烏斯古菌門相對豐度均高于健康草莓，患根腐病草莓根內樣品的奇古菌門和廣古菌門相對豐度均低于健康草莓。屬水平上，所有土壤樣品的優(yōu)勢屬均為亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus）和Methanomassiliicoccus屬，患根腐病草莓根際土壤亞硝化球菌屬相對豐度比健康減少9.27百分點，非根際土壤亞硝化球菌屬相對豐度比健康減少9.87百分點;所有根內樣品的優(yōu)勢屬均為亞硝化球菌屬和甲烷孢菌屬（Methanocella），亞硝化球菌屬相對豐度比健康增加15.13百分點。[結論]健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內樣品古菌群落組成差異明顯，說明草莓根腐病的發(fā)生與根際土壤、非根際土壤以及根內古菌群落結構改變密切相關。

關鍵詞 草莓;根腐病;古菌群落結構;多樣性;高通量測序

中圖分類號 S 436.5文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）02-0147-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.039

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Archaea Community Diversity in Rhizosphere， Non-rhizosphere and Root Tissue of Healthy and Root Rot Strawberry Plants

DAI Rui-qing， LAI Bao-chun， WU Zhen-qiang et al

（Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences of Fujian Province， Zhangzhou， Fujian 363005）

Abstract [Objective]To analyze the archaea community structure and diversity of healthy and root rot strawberry in rhizosphere soil， non-rhizosphere soil and root tissue.[Method]The V3-V4 region of the archaea 16S rRNA gene in rhizosphere soil， non-rhizosphere soil and root tissue was amplified， and the amplified fragments were sequenced by Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology. [Result] Healthy and root rot strawberry group samples got 11 phyla， 19 classes， 25 orders， 29 families， 43 genera and 11 phyla， 20 classes， 27 orders， 32 families， 47 genera， respectively.Thaumarchaeota， Euryarchaeota and Woesearchaeota were the dominant phyla in all soil sample，Thaumarchaeota andEuryarchaeota were the dominant phyla in allroot tissue. Compared with healthy strawberry plants， the relative abundance of Thaumarchaeota inrhizosphere and non-rhizosphere soil of root rot strawberry plant was generally lower， Euryarchaeota and Woesearchaeota was generally greater.The relative abundance of Thaumarchaeota and Euryarchaeotain root tissue of root rot strawberry plant was generally lower than healthy plants. The dominant genera in all soil samples were Nitrososphaera，Nitrosopumilus and Methanomassiliicoccus.Nitrososphaera and Methanocella were the dominant genera in all root tissue samples.Compared with healthy strawberry plants， the relative abundance of Nitrososphaera in rhizosphere and non-rhizosphere soil was 9.27 and 9.87 percentage point lower， respectively，which in root tissue was 15.13 percentage point higher.[Conclusion] There were significant differences in archaea community composition of rhizosphere soil， non-rhizosphere soil and root tissue from healthy and rootrot strawberry. Occurrence of strawberry rootrot was closed to thevariation ofarchaea community structure in field soil and root tissue.

Key words Strawberry;Root rot;Archaea community;Diversity;High-throughput sequencing

基金項目 福建省科技計劃項目（2019N0201）。

作者簡介 戴瑞卿（1990—），女，福建漳浦人，研究實習員，碩士，從事植物病害綜合防控研究。*通信作者，副研究員，碩士，從事植物病害綜合防控研究。

收稿日期 2021-05-19

草莓具有較高的營養(yǎng)價值和經濟價值，素有“水果皇后”之稱[1]。據統(tǒng)計，1994—2016年，我國草莓種植面積和產量逐年增加，規(guī)模逐漸擴大，產量穩(wěn)居世界首位[2]。隨著產業(yè)的發(fā)展，草莓根部病害逐年加重，由土傳病原真菌引起的根腐病是最重要的草莓根部病害之一[3]。根腐病類型多樣、病原菌復雜，目前報道的草莓根腐病病原物已有20多種，如絲核菌屬（Rhizoctonia）、鐮刀菌屬（Fusarium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、疫霉屬（Phytophthora）等，是一種較難防治的土傳病害，嚴重制約草莓產業(yè)的正常發(fā)展[4-7]。

土壤作為微生物群落的“種子庫”，是植物內生菌的最初來源;土壤微生物作為生命元素循環(huán)的驅動者，主導和參與地下生態(tài)系統(tǒng)中一系列重要生態(tài)過程，對土壤能否正常有序地執(zhí)行各項生態(tài)功能至關重要;根際作為植物-土壤生態(tài)系統(tǒng)物質交換的一個界面，是根系-土壤-微生物三者緊密結合并相互交流的場所;植物組織作為特化性更強的環(huán)境，與其共存的微生物群落、植物生長發(fā)育密切相關[8-10]。土壤和植物內生微生物的多樣性能夠影響植物病害的發(fā)生，微生物既可以通過養(yǎng)分競爭和拮抗作用等抑制病原菌的繁殖，促進植物生長，也可以通過病原菌的積累導致植株死亡[5]。因此，分析健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內組織古菌群落結構和多樣性的變化，對了解草莓根腐病發(fā)生的原因及提供相應的防治措施具有重要意義。高通量測序技術可以準確、全面地反映樣本的微生物群落結構，該項技術已被廣泛運用于土壤和植物內生微生物的研究[10]。筆者通過高通量測序技術分析健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內組織古菌群落結構和多樣性，了解草莓根腐病發(fā)生與古菌群落結構改變的關系，為探究草莓根腐病的發(fā)生機制、有效防控草莓根腐病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年3月，于福建省漳州市顏厝鎮(zhèn)草莓種植基地（116°41′03″E，39°91′01″N），選取草莓根腐病暴發(fā)嚴重的草莓種植地進行樣品采集。樣品采集方法參照向立剛等[11]進行，患根腐病草莓植株根際土壤組樣品編號為DJTa、DJTb、DJTc，患根腐病草莓植株非根際土壤組樣品編號為DQTa、DQTb、DQTc，患根腐病草莓根內組樣品編號為DGa、DGb、DGc;健康草莓根際土壤組樣品編號為HJTa、HJTb、HJTc;健康草莓非根際土壤組樣品編號為HQTa、HQTb、HQTc;健康草莓根內組樣品編號為HGa、HGb、HGc。所有樣品置入低溫保藏箱，并迅速帶回實驗室，-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增和高通量測序

稱取500 mg充分混勻的土壤樣品，采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA）提取土壤樣品DNA。采用DNeasy Plant miniKit（Qiagen）提取根內樣品DNA。利用Qubit 3.0熒光定量儀對DNA濃度精確定量。以樣品DNA為模板，進行3輪PCR擴增，第一輪PCR引物為GU1ST-340F（5′-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3′）和GU1ST-1000R（5′-GGCCATGCACYWCYTCTC-3′），PCR擴增體系為30 μL（15 μL 2×Hieff Robust PCR Master Mix，10 μmol/L的Primer F和Primer R各1 μL，10～20 ng DNA）;第二輪PCR引物為V3～V4區(qū)通用引物349F（5′-GYGCASCAGKCGMGAAW-3′）和806R（5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′），PCR擴增體系為30 μL（15 μL 2×Hieff Robust PCR Master Mix，10 μmol/L的Bar-PCR Primer 341F和Primer R各1 μL，10～20 ng DNA）;第三輪PCR擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR擴增體系為30 μL（15 μL 2×Hieff Robust PCR Master Mix，10 μmol/L的Primer F和Index-PCR Primer R各1 μL，10～20 ng DNA）。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min;5個循環(huán)（94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s），20個循環(huán)（94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR 產物采用瓊脂糖試劑盒回收，用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按1∶1 等量混合后，采用Illumina公司的Hiseq 2500 平臺測序進行高通量測序。

1.3 測序數據處理與分析

利用Cutadapt、PEAR（version 0.9.8）、PRINSEQ（version 0.20.4）等軟件對Illumina Miseq測序獲得的序列進行質控和過濾，得到各樣本的高質量序列。利用Usearch軟件（version 11.0.667），按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類。采用RDP classifier貝葉斯算法（version 2.12）對97%相似度水平的OTU代表序列進行分類學分析，統(tǒng)計各個樣品的菌落組成，繪制不同分類水平上古菌類群的相對豐度圖。利用Mothur（version 1.43.0）軟件計算各樣本的Chao、Ace、Shannon、Simpson、Shannoneven 指數，分析樣本古菌的Alpha 多樣性。利用R軟件繪制不同分類的相對豐度熱圖。

2 結果與分析

2.1 測序數據和OTU聚類分析

患根腐病組草莓不同部位的9個樣品共獲得627 774條高質量序列片段，健康草莓組不同部位的9個樣品共獲得609 133條高質量序列片段。在97%相似度水平對樣品序列進行OTU聚類，健康草莓組3個不同部位樣品共鑒定出古菌11個門、19個綱、25個目、29個科、43個屬、251個OTU;患根腐病草莓組3個不同部位樣品共鑒定出古菌11個門、20個綱、27個目、32個科、47個屬、231個OTU（表1）。Venn圖分析結果表明（圖1），OTU水平上，健康組與患根腐病組草莓根際土壤、非根際土壤、根內樣品之間的古菌種類都較為接近，其共有的OTU種類均遠高于2組樣品獨有的種類。

稀釋曲線（rarefaction curve）分析（圖2）表明，健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內樣品的稀釋曲線隨著測序量的增大，物種數量趨于平緩，達到飽和，且2組草莓各部位樣品覆蓋率指數（coverage index）均在0.990 0以上，說明該次測序結果能夠代表樣本的真實情況，測序結果合理。對健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤和根內樣品ɑ多樣性分析（表2），結果表明，患根腐病草莓根際土壤古菌群落豐富度、多樣性和均勻度均低于健康草莓;患根腐病草莓非根際土壤古菌群落豐富度和多樣性低于健康草莓，均勻度高于健康草莓;患根腐病草莓根內樣品古菌群落豐富度、多樣性和均勻度均高于健康草莓。

2.2 古菌群落組成分析

門水平上，健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤的優(yōu)勢門均為奇古菌門（Thaumarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeota）和烏斯古菌門（Woesearchaeota），健康與患根腐病草莓根內樣品的優(yōu)勢門均為奇古菌門和廣古菌門?；几〔葺H土壤奇古菌門相對豐度69.25%，較健康草莓減少11.44百分點，廣古菌門相對豐度3.44%，較健康草莓增加0.14百分點，烏斯古菌門相對豐度2.89%，較健康草莓增加0.39百分點;患根腐病草莓非根際土壤奇古菌門相對豐度73.31%，較健康草莓減少6.88百分點，廣古菌門相對豐度4.49%，較健康草莓增加1.09百分點，烏斯古菌門相對豐度4.03%，較健康草莓增加2.79百分點;患根腐病草莓根內樣品奇古菌門相對豐度93.32%，較健康草莓減少2.36百分點，廣古菌門相對豐度2.49%，較健康草莓減少0.76百分點（圖3）。

屬水平上，健康與患根腐病草莓根際土壤的優(yōu)勢屬均為亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）（74.86%、65.59%）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus）（1.26%、2.54%）和Methanomassiliicoccus屬（1.35%、1.52%）;健康與患根腐病草莓非根際土壤的優(yōu)勢屬均為亞硝化球菌屬（69.06%、59.19%）、亞硝化侏儒菌屬（1.58%、7.24%）、Methanomassiliicoccus屬（1.39%、1.36%）和甲烷孢菌屬（Methanocella）（1.02%、0.74%）;健康與患根腐病草莓根內樣品的優(yōu)勢屬均為亞硝化球菌屬（78.19%、93.32%）和甲烷孢菌屬（1.54%、2.37%）（圖4）。

2.3 群落聚類分析

通過聚類，可以將高豐度和低豐度的分類單元區(qū)分，并以顏色梯度反映樣品之間的群落組成相似度。繪制各樣品前10個屬的相對豐度熱圖（圖5）。土壤和根內樣品的古菌群落結構差異較大，根據進化關系聚類為四大支，其中健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤HJTc、HQTc、DJTa、DJTb、DQTa、DQTc聚為一支，而HJTb、HQTa、HQTb、DJTc、DQTb聚為一大支;根內樣品DGa、DGb、DGc和HGa聚為一支，健康根內樣品HGb和HGc聚為一支。土壤和根內樣品分別被聚為兩大支，說明根際和非根際土壤與根內古菌群落結構差異較大。

3 結論與討論

該研究采用Illumina Hiseq高通量測序技術對健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內樣品古菌群落結構和多樣性進行分析，結果健康組和患根腐病組分別獲得609 133、627 774條高質量序列。該研究用于后續(xù)分析的有效序列眾多，稀釋曲線隨著測序量的增大，物種數量趨于平緩，達到飽和，說明使用該方法分析健康與患根腐病草莓土壤及根內樣品古菌群落結構和多樣性具有可行性。

土壤微生物區(qū)系與植物根系的生長和代謝密切相關，對植物營養(yǎng)元素的供給和植物健康的維持發(fā)揮著重要作用[5，12]。該研究對健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤和根內樣品古菌多樣性分析表明，患根腐病草莓根際和非根際土壤古菌群落豐富度、多樣性均低于健康草莓，患根腐病草莓根內樣品古菌群落豐富度和多樣性高于健康草莓，與楊俊譽等[2]對草莓白粉病的研究結果一致，表明草莓根腐病的發(fā)生與根際土壤、非根際土壤及根內古菌群落結構組成的變化密切相關。

奇古菌門、廣古菌門和烏斯古菌門為健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤的優(yōu)勢門，而健康與患根腐病草莓根內樣品的優(yōu)勢門為奇古菌門和廣古菌門，其中奇古菌門占絕對優(yōu)勢，不同組別的相對豐度在69.25%～95.68%，與前人研究結果一致[2，13]。該研究中健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤的優(yōu)勢屬為亞硝化球菌屬、亞硝化侏儒菌屬和Methanomassiliicoccus屬，健康與患根腐病草莓根內樣品的優(yōu)勢屬為亞硝化球菌屬和甲烷孢菌屬，其中亞硝化球菌屬在所有樣品中占絕對優(yōu)勢，不同組別的相對豐度在59.19%～93.32%。患根腐病草莓根際土壤亞硝化球菌屬相對豐度比健康減少9.27百分點，亞硝化侏儒菌屬相對豐度比健康增加1.28百分點;非根際土壤亞硝化球菌屬相對豐度比健康減少9.87百分點，亞硝化侏儒菌屬相對豐度比健康增加5.66百分點;根內樣品亞硝化球菌屬相對豐度比健康增加15.13百分點。研究表明，亞硝化球菌屬與酸性土壤的氨氧化作用密切相關，是酸性土壤硝化作用的重要驅動者，主要通過增加個別微生物物種的豐度調控土壤酸化程度[14-16]?；几〔葺H和非根際土壤亞硝化球菌屬相對豐度明顯減少，可能是草莓發(fā)生根腐病的原因，而患根腐病草莓根內樣品亞硝化球菌屬相對豐度明顯增加，可能是因為根腐病菌的侵染破壞草莓根系組織，降低草莓自身防御能力，導致根際和非根際土壤中的亞硝化球菌屬向地表的根內遷移[17]。亞硝化侏儒菌屬可以將氨氧化成亞硝酸鹽，通過氨氧化、亞硝酸鹽氧化和反硝化作用，完成氮的循環(huán)，在全球氮循環(huán)中具有重要作用[18-19]。亞硝化球菌屬和亞硝化侏儒菌屬均為氨氧化古菌[20]，患根腐病草莓根際和非根際土壤中的亞硝化球菌屬相對增加，而亞硝化侏儒菌屬相對豐度減少，說明亞硝化球菌屬和亞硝化侏儒菌屬可能存在競爭關系，但相關理論還需進一步研究。

該研究結果表明，草莓根腐病的發(fā)生與根際土壤、非根際土壤和根內古菌群落結構和多樣性的改變密切相關，尤其是亞硝化球菌屬和亞硝化侏儒菌屬相對豐度的改變對草莓根腐病的發(fā)生有重要的影響，為探究草莓根腐病的發(fā)生機制、有效防控草莓根腐病提供科學的指導作用。

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