劉曉軒，李亞梅，肖 邦，楊建瓊，金洪光，黃 浩，李林福，劉 海

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2021級碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江西 贛州 341000；4. 九江學(xué)院，江西 九江 332000；5. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心-客家中醫(yī)藥資源研究分中心，江西 贛州 341000）

感染通常是指細(xì)菌、病毒、真菌等病原體侵入人體所引起的局部組織或全身性反應(yīng)。主要表現(xiàn)為白細(xì)胞增多、貧血、彌漫性血管內(nèi)凝血（Disseminated intravascular coagulation， DIC）、發(fā)熱等癥狀。老人、兒童及免疫功能低下者治療不及時(shí)可能發(fā)展為敗血癥或休克，危及生命。自20 世紀(jì)20 年代青霉素［1］被發(fā)現(xiàn)以來，抗生素成為對抗感染的主要治療方法，拯救了數(shù)以萬計(jì)的生命，被認(rèn)為是20 世紀(jì)最偉大發(fā)現(xiàn)之一［2］?？股赝ㄟ^干擾病原微生物細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)的合成發(fā)揮抗感染作用，作用單一且易產(chǎn)生耐藥性。而中藥具有多靶點(diǎn)、多通路、多機(jī)制的特點(diǎn)，近年來在抗感染治療的研究中受到廣泛關(guān)注［3］。

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）為馬鞭草科紫珠屬植物，主要分布于我國長江流域以南，在江西、福建、廣東、廣西、海南等地均有生長［4-5］。屬于海南大宗性地道藥材，是黎族醫(yī)師常用的藥材之一［6］。裸花紫珠是一種多年生常綠灌木，全年均可采收，以其干燥或帶嫩枝的葉入藥，具有止血凝血、消炎鎮(zhèn)痛、解毒抗菌等作用［7-10］。裸花紫珠化學(xué)成分主要包括黃酮類、苯乙醇苷類、萜類、揮發(fā)油和酚類等，本課題組前期研究獲得15個(gè)裸花紫珠抗菌活性成分［11］分別為：梓醇（Catalpol）、原兒茶酸（Protocatechuic acid）、原兒茶醛（3，4-Dihydroxybenzaldehyde）、咖啡酸（Caffeic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、毛蕊花糖苷（Acteoside）、木犀草苷（Cynaroside）、異毛蕊花糖苷（Isoacteoside）、2'-乙酰基金石蠶苷（Brandioside）、2'-乙?；锘ㄌ擒眨?'-Acetylacteoside）、木犀草素（Luteolin）、槲皮素（Quercetin）、芹菜素（Apigenin）、異鼠李素（Isorhamnetin）、5，4'-二羥基-3，7，3'-三甲氧基黃酮（5，4-Dihydroxy-3'，7'，3'-trimethoxyflavone）。但裸花紫珠抗菌成分發(fā)揮抗感染作用的具體靶點(diǎn)及通路尚不明確，作用機(jī)制有待闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有與中藥作用類似特點(diǎn)，可以系統(tǒng)展示多靶點(diǎn)、多通路的網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，通過數(shù)據(jù)分析實(shí)現(xiàn)藥物與疾病相互作用的可視化［12］，近年來已經(jīng)成為研究中藥藥效基礎(chǔ)及藥效分子作用機(jī)制的一種有效方法［13］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可使大量成分靶點(diǎn)更加系統(tǒng)精確定位，避免了以往研究方法的局限性［14］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將藥物-基因-疾病等模塊關(guān)聯(lián)，以高通量方式從眾多靶點(diǎn)、通路中篩選出相關(guān)信息，證實(shí)藥物的作用機(jī)制及闡明化合物之間的協(xié)同作用［15］，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果需要驗(yàn)證。分子對接技術(shù)可以在分子水平上預(yù)測活性成分與靶點(diǎn)結(jié)合模式，增加結(jié)果可信性，從而對藥物活性成分進(jìn)行輔助篩選［16］。筆者以本課題組前期研究獲得的15 個(gè)裸花紫珠抗菌活性成分為研究對象，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其抗感染作用的相關(guān)靶點(diǎn)和通路進(jìn)行分析和篩選，獲取核心作用靶點(diǎn)，而后采用分子對接技術(shù)對其進(jìn)一步驗(yàn)證，以探究裸花紫珠發(fā)揮抗感染作用的可能或潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件本研究使用的數(shù)據(jù)庫及軟件的功能介紹如表1所示。

表1 數(shù)據(jù)庫及軟件總匯

1.2 15個(gè)裸花紫珠抗菌活性成分獲得根據(jù)本課題組前期對裸花紫珠抗菌作用的譜效學(xué)研究［11］，從裸花紫珠藥材中獲得15個(gè)抗菌活性成分，分別是梓醇、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、木犀草苷、異毛蕊花糖苷、2'-乙?；鹗Q苷、2'-乙?；锘ㄌ擒铡⒛鞠菟?、槲皮素、芹菜素、異鼠李素、5，4'-二羥基-3，7，3'-三甲氧基黃酮。在PubChem數(shù)據(jù)庫中搜索各成分的smile號及CAS號。

1.3 裸花紫珠抗菌活性成分靶點(diǎn)收集將1.2 項(xiàng)中獲得的smile 號及CAS 號在TCMSP 及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中檢索，收集15個(gè)裸花紫珠抗菌活性成分的作用靶點(diǎn)，之后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)蛋白名稱統(tǒng)一為基因名稱。

1.4 感染相關(guān)靶點(diǎn)的篩選及交集靶點(diǎn)的獲得以"inflection"為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索與篩選，選擇相關(guān)性＞1 的靶點(diǎn)作為感染類疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，后將其與裸花紫珠抗菌活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集，通過Bioinformatics & Evolutionary Genomics 網(wǎng)站在線制作Venn 圖，獲得交集靶點(diǎn)信息，得到裸花紫珠抗菌活性成分抗感染的潛在靶點(diǎn)。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選將1.4 項(xiàng)中獲得的交集靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins 后輸入已獲得的交集靶點(diǎn)基因，選擇置信區(qū)間＞0.70，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到裸花紫珠抗菌成分抗感染作用的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction， PPI）。通過Cytoscape 3.9.0 對獲得的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和可視化處理，使用cyto Hubba 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中藥物與疾病的核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體分析（GO）與通路富集分析（KEGG）分析運(yùn)用omicshare 基因數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站，對上述1.4 獲得的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析及KEGG通路富集分析。

1.7 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路圖將上述得到的裸花紫珠中15個(gè)抗菌活性成分、交集靶點(diǎn)、1.6項(xiàng)中富集得到的感染主要相關(guān)信號通路導(dǎo)入Cytscope 3.9.0中，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并通過網(wǎng)絡(luò)度值（degree值）的大小對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.8 分子對接驗(yàn)證先從ZINC 中下載1.7 項(xiàng)中degree 排名前2 的活性成分的Mol2 格式文件，再從RCSB網(wǎng)站下載1.7項(xiàng)中degree值排名前5核心靶點(diǎn)的PDB文件。運(yùn)用Discovery studio 軟件進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。采用libdockscore 值評估兩者之間的結(jié)合能力，若 libdockscore＞100，則提示對接分子能夠自發(fā)進(jìn)行結(jié)合，且結(jié)合穩(wěn)定。

2 結(jié) 果

2.1 裸花紫珠抗菌活性成分靶點(diǎn)收集和交集靶點(diǎn)的獲得15 個(gè)裸花紫珠抗菌活性成分在TCMSP 數(shù)據(jù)庫及Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中收集到作用靶點(diǎn)共356 個(gè)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索與篩選，獲得與感染相關(guān)性＞1的靶點(diǎn)2 916個(gè)。

將疾病靶點(diǎn)與裸花紫珠抗菌活性成分作用靶點(diǎn)成分取交集，制作Venn 圖，得到交集靶點(diǎn)231 個(gè)（圖1）。交集靶點(diǎn)可能是裸花紫珠發(fā)揮抗感染作用的基礎(chǔ)。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 網(wǎng)絡(luò)平臺分析，設(shè)置置信區(qū)間為high confidence 0.70，借助Cytscope 3.9.0，對保存的TSV 格式文件進(jìn)行可視化處理（圖2）。節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，邊代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)連接程度越高說明蛋白質(zhì)之間關(guān)系越密切，以同心圓排列degree 值越高的蛋白節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，越趨于中心位置。通過計(jì)算得到degree 值排名前20 的靶點(diǎn)（表2），其中排名前5的核心靶點(diǎn)為：STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前20靶點(diǎn)特征參數(shù)

圖2 裸花紫珠中15個(gè)抗菌活性成分抗感染的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 分析及KEGG 分析通過omicshare 基因數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站對藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析。GO 功能富集分析共得到8 365 個(gè)GO 條目，其中包含6 750 個(gè)生物學(xué)過程（Biological Process，BP）條 目、601 個(gè) 細(xì) 胞 組 成（Cellular Component，CC）條目和1 014 個(gè)分子功能（Molecular Function，MF）條目，根據(jù)P值選擇最具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)據(jù)作GO分析條狀圖（圖3）。

圖3 GO富集分析條狀圖

主要涉及的生物過程包括細(xì)胞代謝過程（Cellular process）、刺激反應(yīng)（Response to stimulus）、代謝過程（Metabolic process）、生物調(diào)節(jié)功能（Biological regulation）、調(diào)節(jié)生物進(jìn)程（Regulation of biological process）等；涉及到細(xì)胞組成包括細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞組分（Cell part）、細(xì)胞器（Organelle）等；主要分子功能為結(jié)合（Binding）、催化活性（Catalytic activity）、分子功能調(diào)節(jié)器（Molecular function regulator）等。推測靶點(diǎn)基因主要是通過誘發(fā)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)酶的催化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過程達(dá)到抗菌效果。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示上述步驟篩選出的交集基因與癌癥和感染通路相關(guān)性高（圖4），可以證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果可靠。KEGG 共富集通路272 條，根據(jù)P值排序選擇排名前20 的通路進(jìn)行展示，其中17 個(gè)與人類疾病相關(guān)，2 個(gè)與環(huán)境因素有關(guān)，1 個(gè)與微生物有關(guān)。根據(jù)P值排序，相關(guān)性排名前5 的信號通路依次為： Pathways in cancer、Human cytomegalovirus infection、Proteoglycans in cancer、MicroRNAs in cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（圖5、表3）。

表3 KEGG通路富集分析排名前20的信號通路

圖4 KEGG通路富集結(jié)果

圖5 KEGG通路富集分析圈圖

2.4 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路圖將藥材裸花紫珠中15 種抗菌活性成分、交集靶點(diǎn)及富集得到的信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。成分-靶點(diǎn)-通路圖中有272 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 210 條邊。根據(jù)degree 值大小設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小，degree 值越大節(jié)點(diǎn)越大。排名前5 的活性成分為：Quercetin、Luteolin、Apigenin、5，7-Dihydroxy-3'，4'，5'-trimethoxyflavone、Isorhamnetin；排 名 前5 信 號 通 路 為：Human cytomegalovirus infection、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、 Hepatitis B、 Human papillomavirus infection、 Epstein-Barr virus infection。

圖6 成分-靶點(diǎn)-通路圖

2.5 分子對接將degree 值排名前2 的化合物作為代表性藥物分子與degree 值排名前5 的核心靶點(diǎn)（表4）進(jìn)行分子對接驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，木犀草 素（Luteolin）和 槲 皮 素（Quercentin）與STAT3、TNF、AKT1、IL-6、VEGFA 的libdockscore 均＞100，木犀草素-AKT1，槲皮素-STAT3 有更高的libdockscore值，說明本課題組前期篩選出的裸花紫珠抗菌活性成分可靠，且AKT1 與STAT3 可能為發(fā)揮抗感染作用的主要靶點(diǎn)。對配體-受體復(fù)合物進(jìn)行可視化展示可以得到藥物小分子木犀草素和槲皮素，能夠分別穩(wěn)定對接到蛋白AKT1、STAT3 的活性口袋中，對接2D 結(jié)構(gòu)示意圖（圖7、圖8）顯示藥物小分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合主要為氫鍵和Π 鍵，Π 鍵主要包括烷基-Π 鍵（Pi-alkyl）、陰離子-Π 鍵（Pi-cation）、陽離子-Π鍵（Pi-anion），除此之外鹽橋、范德華力和碳?xì)滏I等也在某些分子結(jié)合中發(fā)揮作用。分子對接2D 結(jié)果顯示，藥物小分子木犀草素與靶點(diǎn)蛋白AKT1 中的ASP、THR、PRO、MET、HIS 等氨基酸殘基結(jié)合；藥物小分子槲皮素與靶點(diǎn)蛋白STAT3 中的ARG、LYS、ASN、HIS、SER等氨基酸殘基結(jié)合。

圖7 木犀草素-AKT1 分子對接結(jié)果及結(jié)合方式

圖8 槲皮素-STAT3分子對接結(jié)果及結(jié)合方式

表4 degree值排名前5的核心靶點(diǎn)蛋白RCSB號

表5 分子對接Libdockscore值

3 討 論

感染一般是由病原微生物侵入人體導(dǎo)致，表現(xiàn)為局部血流量增加、組織液滲出、白細(xì)胞聚集增多等，與“炎癥”表現(xiàn)相似［17-19］。張靜怡等［20］研究發(fā)現(xiàn)，止癢皮膚液因含有抗炎抗菌成分對皮疹有更好的治療效果，裸花紫珠不僅可以抗菌還具有消炎、解毒等作用［21］，因此對于感染類疾病的治療可能具有更加優(yōu)越的治療效果。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)圖得到degree 值排名前5 的核心靶點(diǎn)為STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA。孫云等［22］研究發(fā)現(xiàn)，IL6、STAT3 與孕婦B 族鏈球菌感染有關(guān)；雷聲云等［23］研究發(fā)現(xiàn)，女性人乳頭瘤病毒感染與STAT3 相關(guān)。STRANGFELD A 等［24］通過免疫和臨床研究發(fā)現(xiàn)，TNF 在防御細(xì)菌感染中起到非常關(guān)鍵的作用，使用TNF 抑制劑治療的患者具有更高的細(xì)菌易感性。此外，俞曉進(jìn)等［25］通過建立小鼠動物模型證實(shí)，多種細(xì)菌可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TNF，TNF主要通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和改善代謝來抵御細(xì)菌侵襲，證明TNF 在抗菌感染中發(fā)揮重要作用。ZHAO J 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，TNF、AKT1、IL6 為清肺排毒湯治療新冠肺炎的關(guān)鍵分子。GUAN J等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌感染時(shí)IL-6表達(dá)上調(diào)，治療后IL-6表達(dá)下降。SHEN X 等［28］通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選地榆抗幽門螺桿菌得出AKT1、VEGFA 等為核心靶點(diǎn)。LIU G 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶（AKT1）在細(xì)菌感染時(shí)被下調(diào)，在急性炎癥性肺損傷和金黃色葡萄球菌感染小鼠模型中，AKT1 缺乏導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病進(jìn)展，伴隨著中性粒細(xì)胞的募集和殺菌活性的增強(qiáng)。YANG R 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA 可以通過調(diào)節(jié)TLR2-MAPK-ERK1/2 信號通路參與腦膜炎大腸桿菌誘導(dǎo)的血腦屏障破壞，表明VEGFA為預(yù)防臨床大腸桿菌腦膜炎的基本靶標(biāo)。由此可知，本文篩選出的前5 個(gè)核心靶點(diǎn)STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA均參與炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，表明裸花紫珠中抗菌活性成分可能是通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗感染作用。

最后通過分子對接技術(shù)對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，祼花紫珠抗菌活性代表性成分木犀草素、槲皮素與核心靶點(diǎn)中degree 值排名前5的基因?qū)咏Y(jié)果良好，其中AKT1、STAT3 具有更高的結(jié)合趨勢。

4 結(jié) 論

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對15 個(gè)裸花紫珠抗菌活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，而后選擇核心靶點(diǎn)degree 值排名前5 的靶點(diǎn)STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA 分別與代表性藥物進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果均良好，其中AKT1、STAT3 具有更高的libdockscore值，表明AKT1、STAT3 可能為裸花紫珠發(fā)揮抗感染作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。推測裸花紫珠抗菌活性成分主要通過調(diào)控細(xì)胞代謝和人體免疫應(yīng)答發(fā)揮抗感染作用。本研究可為后續(xù)裸花紫珠抗感染作用機(jī)制的深入研究指明方向。