蒙愛(ài)， 魏思昂,， 丁志文， 馮焱*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 太谷 030801； 2.復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院心血管病研究所， 上海 200032)

短鏈脂肪酸 (short chain fatty acids, SCFAs) 是特定結(jié)腸厭氧菌發(fā)酵膳食纖維后產(chǎn)生的主要細(xì)菌代謝產(chǎn)物，主要包括：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸[1]，SCFAs 通過(guò)擴(kuò)散或者被結(jié)腸上皮細(xì)胞主動(dòng)吸收后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，一方面大部分的 SCFAs 可作為能量物質(zhì)參與機(jī)體新陳代謝，另一方面作為 HDACi 調(diào)控基因的表觀遺傳[2]。目前大量的研究表明 SCFAs 對(duì)機(jī)體外周免疫及中樞神經(jīng)系統(tǒng) (central nervous systerm, CNS) 免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。膳食纖維的攝入減少或腸道微生物群的限制與炎性腸疾病和心血管疾病的發(fā)展有關(guān)[3-6]，這強(qiáng)調(diào)了SCFAs是重要的免疫調(diào)節(jié)代謝物。

SCFAs可通過(guò)結(jié)合SCFAs受體發(fā)揮作用。目前，已發(fā)現(xiàn)的SCFAs受體主要為G蛋白偶聯(lián)受體 (G-protein-coupled receptors, GPR)，包括GPR41、GPR43和GPR109[7- 8]。GPR41和GPR43又被稱為游離脂肪酸受體3 (free fatty acid receptor 3, FFAR3) 和FFAR2，廣泛存在于免疫細(xì)胞和腸上皮內(nèi)分泌細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞中。如GPR43可在腸內(nèi)分泌細(xì)胞、免疫細(xì)胞、脂肪細(xì)胞中大量表達(dá)[9]；GPR41在平滑肌細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)；GPR109A可在大腸上皮細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和免疫細(xì)胞中大量表達(dá)[10]。其中，GPR43和GPR41可被乙酸、丙酸和丁酸激活，GPR109A可被丁酸激活。通過(guò)激活GPCRs受體，SCFAs可激活免疫反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腸黏膜中發(fā)揮抗炎作用[11]。乙酸、丙酸和丁酸均可結(jié)合并激活GPR41和GPR43，參與調(diào)節(jié)器官的代謝、免疫和能量穩(wěn)態(tài)。在缺血性腦梗死的研究中表明，梗死降低了 SCFAs 在腸道內(nèi)的水平[12]。乙酸是消化道內(nèi)生物代謝的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物，其濃度對(duì)動(dòng)物的腸道健康發(fā)揮著巨大作用[13]；與其他種類 SCFAs相比，丙酸可通過(guò)血液吸收到達(dá)不同器官，作為脂肪生成和糖質(zhì)新生的底物，并能通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體GPR41和GPR43結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)；丁酸的腦保護(hù)作用最強(qiáng)補(bǔ)充丁酸治療缺血性模型可以過(guò)重塑腸道菌群，豐富有益的乳酸菌，修復(fù)腸道屏障，是治療缺血性腦梗死的有效方法[14]。

嗅覺(jué)感受受體 (olfactory receptor, Olfr) 78 (也稱為OR51E2) 為一種新發(fā)現(xiàn)的SCFAs受體，主要分布于腎臟和血管，參與調(diào)節(jié)腎素的分泌，可與GPR41、GPR43相互拮抗共同調(diào)節(jié)機(jī)體的血壓水平[15]。迄今為止，關(guān)于OR51E2基因家族全基因組的分析仍然缺乏。基于此，現(xiàn)采用生物信息學(xué)方法對(duì)人源OR51E2基因家族基因序列進(jìn)行分析，進(jìn)一步比較其蛋白組分、結(jié)構(gòu)、理化特性、系統(tǒng)發(fā)育和直腸腺癌關(guān)系，以期為OR51E2基因家族在遺傳進(jìn)化過(guò)程和疾病治療研究提供有力的基礎(chǔ)支撐。

1 材料和方法

1.1 基因序列獲取

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載人源OR51E2基因家族序列，主要包括OR51E1、OR51E2。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載人、大鼠、小鼠、雞、蛙和G.bichir(塞內(nèi)加爾多鰭魚) 等脊椎動(dòng)物蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2 人源OR51E2基因家族序列比對(duì)和保守基序預(yù)測(cè)

利用MEGA-X軟件對(duì)人源OR51E2基因家族蛋白序列比對(duì)，首先使用 Blast P 和 T Blast N 算法搜索智人，預(yù)測(cè)基因的蛋白序列和基因組序列，常數(shù)e閾值選擇10-5。然后將獲得的序列與 Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較， 檢測(cè)是否存在OR51E2保守結(jié)構(gòu)域。接然后提交到 MEME 在線網(wǎng)站對(duì)其保守基序進(jìn)行分析，參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

1.3 氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和理化特性分析

用Expasy 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因蛋白氨基酸組成和相關(guān)理化性質(zhì)分析獲得蛋白的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的信息。采用 Protparam-tool工具對(duì)編碼氨基酸序列和氨基酸組成分析。采用SWISS-model工具對(duì)下載的氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用PYMOL軟件將OR51E1和OR51E2結(jié)構(gòu)可視化。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

采用鄰接法 (neighbor-joining, NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行校正，校驗(yàn)參數(shù) Bootstrap 重復(fù)1 000次，得到最終的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 OR51E2生物學(xué)作用分析

使用GeneMIANA軟件分析OR51E2相關(guān)的共表達(dá)、相互作用、共定位、共享蛋白結(jié)構(gòu)域網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路等相關(guān)生物學(xué)作用。

1.6 OR51E2基因在直腸腺癌中表達(dá)和預(yù)后分析

通過(guò)GEPIA2分析OR51E2在直腸腺癌患者和正常健康人基因表達(dá)和預(yù)后。設(shè)置條件為總體生存，95%置信區(qū)間，基于COX PH模型計(jì)算危險(xiǎn)度。

2 結(jié)果分析

2.1 人源OR51E2基因家族鑒定和理化特性分析

人源OR51E2基因家族一共包含兩種，即OR51E1和OR51E2。氨基酸組成 (圖1) 分析顯示含量最高和最低的分別為亮氨酸和色氨酸，但是其他氨基酸在蛋白含量有所差異，如異亮氨酸在OR51E1蛋白中含量 (9.7%) 在第二位，但在OR51E2蛋白中含量第二位的是纈氨酸 (10.6%)，序列比對(duì)結(jié)果 (圖2) 顯示，二者在整體氨基酸組成上基本保守，為了進(jìn)一步體現(xiàn)二者在結(jié)構(gòu)域生物學(xué)作用的保守性，用MEME軟件分析展示了3種基序 (圖3)。蛋白結(jié)構(gòu) (圖4) 顯示，人源OR51E1、OR51E2為單鏈結(jié)構(gòu)，且α-螺旋結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)地位，OR51E1蛋白N端α-螺旋結(jié)構(gòu)較OR51E2長(zhǎng)，表明OR51E1、OR51E2在功能上存在差異。理化特性顯示 (表1)，OR51E1包含318個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為35 402.40，等電點(diǎn)為8.71，無(wú)信號(hào)肽；OR51E2包含320個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為35 492.64，等電點(diǎn)為9.16，無(wú)信號(hào)肽，OR51E1、OR51E2為非分泌蛋白。此外，結(jié)構(gòu)域顯示OR51E1、OR51E2均包含一個(gè)7tm4功能結(jié)構(gòu)域，分別在氨基酸33～310和30～309區(qū)段。

A為丙氨酸；R為精氨酸；N為天冬酰胺；D為天冬氨酸；C為半胱氨酸；Q為谷氨酰胺；E為谷氨酸；G為甘氨酸；H為組氨酸；I為異亮氨酸；L為亮氨酸；K為賴氨酸；M為甲硫氨酸；F為苯丙氨酸；P為脯氨酸；S為絲氨酸；T為蘇氨酸；W為色氨酸；Y為酪氨酸； V為頡氨酸圖1 人源OR51E1、OR51E2氨基酸組成分析 Fig.1 Amino acid composition analysis of human OR51E1 and OR51E2

圖2 人源OR51E1、OR51E2序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence alignment results of human OR51E1 and OR51E2

圖3 人源OR51E1、OR51E2保守基序Fig.3 Conserved motifs of human OR51E1 and OR51E2

圖4 人源OR51E1、OR51E2高級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Advanced structure of human OR51E1 and OR51E2

表1 人源OR51E1、OR51E2理化特性分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of human OR51E1 and OR51E2

2.2 OR51E2蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

為了研究OR51E2蛋白家族系統(tǒng)狀況，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載了人、大小鼠、雞、兔、蛙和G.bichir等14條蛋白序列構(gòu)建OR51E2蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，進(jìn)化樹(shù)為有根樹(shù)，根源動(dòng)物為G.bichir，進(jìn)化樹(shù)主要分為三簇，OR51E1、OR51E2和OR51E2_ (G.bichir的一類蛋白)。OR51E1包含5類：人、兔、狗、牛和蛙，OR51E2包含6類：人、大小鼠、狗、雞、牛，OR51E2_包含OR51E2三種亞型。在OR51E1簇中人與兔親緣性最近，OR51E2簇中人與狗親緣性最近，而大小鼠親緣性最近。OR51E2_簇中OR51E2_1與OR51E2_2親緣性最近。從整體進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，OR51E2蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)動(dòng)物親緣性從水生動(dòng)物 (G.bichir)-兩棲動(dòng)物 (蛙)-陸生動(dòng)物 (人)。

M.musculus為小鼠；Rat為大鼠；Dog為狗；H.sapiens為 人；Cattle為 牛； Chichen為 雞；Frog為蛙；Rabbit為 兔； G.bichir為塞內(nèi) 加爾多鰭魚 圖5 OR51E2蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of OR51E2 protein family

2.3 OR51E2生物學(xué)作用

用Gene MANIA軟件分析OR51E2的生物學(xué)作用 (圖6)。OR51E2共表達(dá)基因包含：AKT3、NRL、GNGT1、PRAC1、SLC45A3、ANO7、NKX3-1、KLK4、OR51E1、PAEP、NPY、KLK2、KLK3、TGM4、SEMG2、FAM159A、OR51E2、CPNE4。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)OR51E2與AKT3、NRL相互作用，并且AKT3、NRL為OR51E2上下游作用因子。共蛋白結(jié)構(gòu)域和信號(hào)通路顯示OR51E2與GNB1、GNGT1、GNAL、ARRB2存在同一個(gè)群體之中。

圖6 OR51E2生物相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Biological interaction network of OR51E2

2.4 OR51E2基因在直腸腺癌中表達(dá)和預(yù)后分析

由于OR51E2是一種SCFAs受體蛋白，在腸道的生理功能發(fā)揮重要的功能，研究OR51E2基因在直腸腺癌中的表達(dá)和預(yù)后至關(guān)重要。采用GEPIA2軟件對(duì)OR51E2基因在直腸腺癌患者和健康人的mRNA和預(yù)后分析，結(jié)果如圖7(a)所示，OR51E2mRNA表達(dá)量在直腸腺癌患者顯著降低，生存曲線分析[圖7(b)] 顯示OR51E2差異表達(dá)對(duì)預(yù)后有影響，高風(fēng)險(xiǎn)比值為1.5，但是時(shí)序檢驗(yàn)logrankP=0.38，無(wú)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)腸癌患者共納入92例，健康患者318例，紅色盒子為直腸癌患者OR51E2mRNA表達(dá)量；灰色盒子為健康人OR51E2mRNA表達(dá)量。

TPM為每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄；logrank為時(shí)序檢驗(yàn)；HR為高風(fēng)險(xiǎn)比值；n為數(shù)量圖7 OR51E2基因在直腸腺癌中表達(dá)和預(yù)后分析Fig.7 Expression and prognosis of OR51E2 gene in rectal adenocarcinoma

3 討論

OR51E2基因家族是動(dòng)物特有的基因，負(fù)責(zé)氣味信號(hào)的識(shí)別和G蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在免疫、炎癥和結(jié)直腸癌均起著重要作用[16]。而現(xiàn)今，關(guān)于OR51E2基因研究相對(duì)較少，現(xiàn)基于生物信息學(xué)對(duì)人源OR51E2基因家族綜合分析，在人源OR51E1、OR51E2基因中包含3個(gè)保守基序。基因組的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)是展示功能差異的主要區(qū)別。人源OR51E2基因家族中OR51E1氨基酸組成和α-螺旋結(jié)構(gòu)較OR51E2存在某些差異，說(shuō)明這些氨基酸和α-螺旋結(jié)構(gòu)改變了基因的功能，可能在基因的進(jìn)化過(guò)程中將基因序列改變和丟失以產(chǎn)生各種機(jī)體需要的功能。OR51E1、OR51E2開(kāi)放閱讀框含有大量相同的保守基序，表明在參與機(jī)體的生物學(xué)功能中二者存在一定的相似性。

進(jìn)化樹(shù)中相同分支的基因可能有相似的功能，OR51E1、OR51E2與嗅覺(jué)氣味分子相互作用，啟動(dòng)一種神經(jīng)元反應(yīng)，觸發(fā)對(duì)氣味的感知。同樣位于OR51E2_簇中的G.bichir中的 OR51E2基因家族成員，可能也有類似的功能；大小鼠也通過(guò)OR51E2蛋白在嗅覺(jué)相關(guān)功能發(fā)揮重要作用。

從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)化樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)，OR51E2基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)包含三簇，OR51E1簇中人與兔親緣性最近，OR51E2簇中人與狗親緣性最近。OR51E2_簇中OR51E2_1與OR51E2_2親緣性最近。從整體進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，OR51E2蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)動(dòng)物親緣性從水生動(dòng)物 (G.bichir)-兩棲動(dòng)物(蛙)-陸生動(dòng)物 (人)?；蛟谶M(jìn)化過(guò)程中為了更利于生存進(jìn)化和改變一些原有的功能是普遍現(xiàn)象，可能是自然選擇和蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果。

Jovancevic等[17]研究發(fā)現(xiàn)OR51E2的活化誘發(fā)ERK1/2和AKT的激活，從而激活后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞細(xì)胞遷移和增殖增加。NRL編碼Maf亞家族的基本基序-亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，編碼的蛋白在脊椎動(dòng)物中是保守的，并且是光感受器發(fā)育和功能的關(guān)鍵內(nèi)在調(diào)節(jié)劑。臨床研究顯示布哈拉猶太人NRL突變?cè)黾涌赡茉黾恿搜奂⌒图I(yíng)養(yǎng)不良癥患病風(fēng)險(xiǎn)[18]。本文研究中的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，OR51E2與AKT3、NRL在同一信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)功能，暗示 OR51E2可能在腸道細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝和細(xì)胞增殖有關(guān)。

嗅覺(jué)感受器屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，在介導(dǎo)多種細(xì)胞功能的非感覺(jué)性組織中均有異位表達(dá)。Gelis等[19]研究表明OR51E2激活后細(xì)胞內(nèi)Ca2+和cAMP升高，從而介導(dǎo)黑色素合成的增加。抑制腫瘤細(xì)胞的OR51E2表達(dá)能夠有效抑制這種癌細(xì)胞增加的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[20]。先前研究表明OR51E2在前列腺瘤和黑色素瘤中癌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控[21-23]。但是關(guān)于OR51E2在腸道疾病的報(bào)道并不多，Kotlo等[24]研究結(jié)果表明Olfr-78基因敲除小鼠感染、免疫、炎癥和結(jié)直腸癌相關(guān)基因發(fā)生了顯著變化，在葡聚糖硫酸鈉和2，4，6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中表達(dá)下調(diào)。這與本文研究發(fā)現(xiàn)在直腸腺癌患者的OR51E2顯著降低相一致。暗示OR51E2可能在腸道炎癥中發(fā)揮重要作用。需要進(jìn)一步研究了解OR51E2在人腸道是如何調(diào)節(jié)腸道的病理生理過(guò)程。

4 結(jié)論

對(duì)人源OR51E2基因家族做了全基因組的生物信息學(xué)鑒定和分析，一共發(fā)現(xiàn)了OR51E1和OR51E2兩個(gè)基因。進(jìn)一步分析人源OR51E2基因家族基因氨基酸組成、結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、理化特性等。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)表明OR51E2基因家族經(jīng)歷了自然選擇。最后通過(guò)基因表達(dá)和生存曲線分析顯示OR51E2在直腸腺癌的病理學(xué)過(guò)程中起著重要作用，這為進(jìn)一步研究OR51E2基因家族的功能和在病理學(xué)過(guò)程起到的作用奠定了基礎(chǔ)。