劉 晴 朱春雪 劉承雨 王一成 何美娟 何嫣婕 黃漢鵬

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江 212000

炎癥是機體的一種防御性反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)會引起機體損傷[1-3]。炎癥反應(yīng)中單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活，分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）等，參與組織損傷；上述炎癥介質(zhì)也可以反向激活巨噬細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)[4]。細(xì)胞自噬通過抑制促炎復(fù)合物、清除病原微生物等保護細(xì)胞，但過度的自噬也會加重機體損傷[5-7]。

急性咽炎起病急，進展快[8-9]，中醫(yī)藥療效好、副作用少，已廣泛用于急性咽炎的治療[10-11]。苦金片清熱利咽、消腫止痛，可用于急性咽炎，但相關(guān)機制不明[7-8]。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7 細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型，旨在探討苦金片對細(xì)胞炎癥損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）購自上海酶研科技有限公司；LPS、caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase，GAPDH）、TNF-α、膜型微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（light chain 3，LC3）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、自噬相關(guān)基因5（autophagy associated protein 5，ATG5）、p62 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司（貨號分別為#14011、#9662、#2118、#11948、#3868、#3711、#2630、#23214）；苦金片（上海醫(yī)藥集團青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：170903）；高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司，美國）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（TaKaRa 公司，日本，生產(chǎn)批號分別為AJG2280A、AJ91708A）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海，生產(chǎn)批號：No.090120201103）；CCK8 試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，生產(chǎn)批號：PK513）。

1.2 研究方法

1.2.1 苦金片水提物的制備 苦金片置磷酸緩沖鹽溶液中，60℃水浴4 h，3500 r/min 離心10 min（離心半徑20 cm），0.22 μm 過濾，-20℃保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8 法檢測RAW264.7 細(xì)胞活力 RAW264.7細(xì)胞按每孔1×104個細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板培養(yǎng)。為觀察苦金片對細(xì)胞存活率的影響，設(shè)立苦金片低、中、高劑量組（1、2、4 mg/ml）及空白組、對照組（加入等量培養(yǎng)基）、LPS（1 μg/ml）組，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，每孔加入CCK8 試劑10 μl 后孵育1.5 h，檢測450 nm 光密度（optical density，OD）值，細(xì)胞活性（%）=（給藥組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）×100%。實驗重復(fù)5 次。

1.2.4 實驗分組 RAW264.7 細(xì)胞按每孔1×105個細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔板并分為三組：對照組、LPS組與苦金片組，每組設(shè)置5 個復(fù)孔。LPS 組予LPS（1 μg/ml）刺激12 h，苦金片組在LPS 刺激后予苦金片（1 mg/ml）刺激4 h，對照組不予特殊處理。

1.2.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng) Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，30 s，預(yù)變 性；95℃，5 s，60℃，30 s，40 個循 環(huán)；95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，10 s，解離階段。用于聚合酶鏈反應(yīng)的引物序列為：IL-6：正向引物：5’-CTCCCAACAGACCTGTCTATAC-3’，反向引物：5’-CCATTGCACAACTCTTTTCTCA-3’；TNF-α：正向引物：5’-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3’，反向引物：5’-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3’；TGF-β：正向引物：5’-CCAGATCCTGTCCAAACTAAGG-3’，反向引物：5’-CTCTTTAGCATAGTAGTCCGCT-3’；LC3Ⅱ：正向引物：5’-GCAGGCGGGTGATTATAGAG-3’，反向引物：5’-CCATTCACCAGGAGGAAGAA-3’；ATG5：正向引物：5’-CAACCG-GAAACTCATGGAAT-3’；GAPDH：正向引物：5’-GCTCAGAACACCTATGGGGA-3’，反向引物：5’-TCACAAGCTTCCCGTTCTCA-3’，反向引物：5’-ACCTGGCT-CCTCTTCTCTCC-3’。結(jié)果用2-ΔΔCt表示。實驗重復(fù)3 次。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法 各組細(xì)胞充分裂解后離心，收集總蛋白，加熱變性后取20 μg 蛋白上樣，凝膠電泳（80 V 30 min，110 V 1 h）后轉(zhuǎn)膜（300 mA 2 h），室溫封閉1.5 h，分別用GAPDH 抗體（1∶1000）、TNF-α抗體（1∶1000）、caspase-3 抗體（1∶1000）、LC3Ⅱ抗體（1∶1000）、p62 抗體（1∶1000）4℃過夜。清洗后加入二抗孵育（室溫1.5 h），曝光，Image J 軟件分析灰度。實驗重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間兩兩比較采用t 檢驗，多組間比較采用ANOVA 檢驗，組內(nèi)比較采用SNK-q 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦金片對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，LPS 組細(xì)胞活力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；苦金片各組細(xì)胞活力均高于LPS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。苦金片各組間細(xì)胞活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），因此后續(xù)實驗選擇苦金片濃度為1 mg/ml。見表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較（%，，n=5）

表1 各組細(xì)胞活力比較（%，，n=5）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與LPS 組比較，bP ＜0.05。LPS：脂多糖

2.2 苦金片對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞相關(guān)基因表達的影響

與對照組比較，LPS 組IL-6、TNF-α、TGF-β、ATG5、LC3ⅡmRNA 表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；苦金片組IL-6、TNF-α、TGFβ、ATG5、LC3ⅡmRNA 表達水平明顯低于LPS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組相關(guān)基因表達比較（，n=3）

表2 各組相關(guān)基因表達比較（，n=3）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與LPS 組比較，bP ＜0.05。LPS：脂多糖；IL：白細(xì)胞介素；TNF：腫瘤壞死因子；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長因子β；ATG5：自噬相關(guān)蛋白5；LC3Ⅱ：膜型微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3Ⅱ

2.3 苦金片對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較，LPS組TNF-α、LC3 Ⅱ、p62 和caspase-3 蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；苦金片組TNF-α、LC3Ⅱ、p62 和caspase-3 水平明顯低于LPS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3、圖1。

表3 各組相關(guān)蛋白表達變化比較（，n=3）

表3 各組相關(guān)蛋白表達變化比較（，n=3）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與LPS 組比較，bP ＜0.05。LPS：脂多糖；TNF：腫瘤壞死因子；LC3Ⅱ：膜型微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3Ⅱ

3 討論

急性咽炎多因細(xì)菌、病毒感染所致，西醫(yī)多用抗生素治療，易產(chǎn)生耐藥性。急性咽炎在中醫(yī)學(xué)中被稱為“急喉痹”，“咽喉口齒諸病，皆屬于火”，以清熱利咽止痛為治則[12-13]。

苦金片由苦地丁、金銀花、黃芩、牛蒡子、玄參、桔梗、甘草組成，方中苦地丁清熱解毒、涼血消腫，金銀花疏散風(fēng)熱，黃芩清肺熱，牛蒡子清熱利咽，玄參增強苦地丁清熱解毒的功效，桔梗載藥上行，甘草調(diào)和諸藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，生物堿是苦地丁抗炎藥效組分，其抗炎作用機制可能是抑制TLRs/NF-κB 信號通路[14-15]；金銀花具有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝利膽、降血糖、降血脂、增強免疫的作用[16-17]；黃芩[18-19]、牛蒡子[20-21]、玄參[22]抑制炎癥介質(zhì)釋放。全方具有清熱利咽、消腫止痛的功效。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞經(jīng)苦金片處理后，可明顯對抗LPS 所致的IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 表達及TNF-α 蛋白水平上升，提示苦金片體外有良好抗炎作用。

細(xì)胞自噬與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，模式識別受體Toll 樣受體的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，細(xì)胞自噬又對炎癥反應(yīng)有調(diào)控作用，細(xì)胞自噬缺損是誘發(fā)炎癥的一個重要因素[23-25]。LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG5、自噬中間體LC3Ⅱ和p62 的積累，適度的自噬可以清除受損的細(xì)胞器，減輕炎癥反應(yīng)，而本研究中細(xì)胞自噬并未阻止炎癥的發(fā)生，這可能是自噬體與溶酶體融合受阻或溶酶體降解受阻所致。將苦金片作用于LPS 處理后的RAW264.7 細(xì)胞，顯著抑制了LPS 誘導(dǎo)的自噬中間體的增加及細(xì)胞活力的下降。此外，caspase-3 蛋白的表達顯著降低，提示苦金片還具有一定的抗凋亡作用。

綜上，本研究通過建立巨噬細(xì)胞炎癥模型，除了證實苦金片的抗炎效用外，還發(fā)現(xiàn)苦金片具有抗凋亡作用、細(xì)胞自噬可能參與了苦金片的抗炎過程，這為苦金片用于多系統(tǒng)炎癥疾病的治療提供了理論依據(jù)。