杜 恒 吳安定 張紅英 余 潔 簡 輝

湖北省黃岡市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北黃岡 438000

研究表明，腫瘤炎癥微環(huán)境可分泌炎癥因子誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發(fā)生，促進(jìn)其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[1-2]。白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞重要的炎癥、免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，與腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、增殖密切相關(guān)[3-4]。已有研究表明IL-6 可誘導(dǎo)胃癌、肝癌EMT 的發(fā)生[5-7]。雙歧桿菌體通過黏附和定植于腸道黏膜上皮細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤、抑菌、抗氧化、抗感染、免疫應(yīng)答等多種作用[8]，但其對結(jié)腸癌細(xì)胞炎癥環(huán)境及EMT 的影響仍不是十分清楚。本研究通過將雙歧桿菌與HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，探討雙歧桿菌對HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞炎癥微環(huán)境及EMT 的影響，為結(jié)腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116（iCell 公司，貨號：iCellh071）；雙歧桿菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，貨號：BNCC180715）；IL-6 抗體（Abcam 公司，貨號：ab23 3706）；上皮鈣黏素抗體（Abcam 公司，貨號：ab40772）；神經(jīng)鈣黏素抗體（Abcam 公司，貨號：ab18203）；GAPDH抗體（Abcam 公司，貨號：ab37168）；Cy3 標(biāo)記山羊抗兔（Aspen 公司，貨號：AS-1109）；BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（Aspen 公司，貨號：AS1086）；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（Aspen 公司，貨號：AS1086）；抗熒光淬滅封片劑（武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司，貨號：AS1089）；倒置顯微鏡（OLYMPUS 公司，IX51 型號）；成像系統(tǒng)（Q-IMAGING 公司，MicroPublisher 型號）；Transwell 板（8 μm，Corning 公司，3422 型號）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的McCOY’s 5A 培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組

將HCT116 細(xì)胞按2×105個/孔的方式接種于6 孔板上，過夜待細(xì)胞貼壁后，雙歧桿菌組將培養(yǎng)基換成含80 μg/ml 雙歧桿菌的完全培養(yǎng)基，對照組采用普通完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，對各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.4 Western blot 檢測

對兩組進(jìn)行裂解，收集總蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，在10% SDS-PAGE 膠孔中加入等量總蛋白進(jìn)行電泳，再經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移目的蛋白至PVDF 膜上，加入稀釋的IL-6 抗體（1∶1000）、上皮鈣黏素抗體（1∶1000）和神經(jīng)鈣黏素抗體（1∶1000），經(jīng)TBST 緩沖液清洗后，加入二抗稀釋液雜交（1TBST5000），ECL 顯影、定影，最后用AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。每組3 個復(fù)孔。

1.5 免疫熒光技術(shù)檢測IL-6、上皮鈣黏素和神經(jīng)鈣黏素的表達(dá)及定位

將兩組細(xì)胞接種放置滅菌蓋玻片的6 孔板內(nèi)，2×105個/孔，每組3 個復(fù)孔。按照“1.3”所述處理細(xì)胞后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%Triton 打孔，5%牛血清白蛋白封閉，再加入IL-6 抗體（1∶50）、上皮鈣黏素抗體（1∶200）和神經(jīng)鈣黏素抗體（1∶200），4℃孵育過夜，脫色搖床晃動洗滌，磷酸鹽緩沖液清洗，Cy3 標(biāo)記的二抗（1∶50）室溫孵育50 min，磷酸鹽緩沖液清洗，加入50～100 μl 的DAPI 染液，室溫孵育5 min，磷酸鹽緩沖液清洗，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.6 細(xì)胞劃痕試驗和Transwell 小室實驗

1.6.1 細(xì)胞劃痕實驗 6 孔板每孔中加入2 ml 約有5×105個HCT116 細(xì)胞的培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿孔板底部90%后，用10 μl 無菌移液槍槍頭劃出均勻直線，用無菌磷酸鹽緩沖液漂洗劃下的細(xì)胞，加入2 ml 完全培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下拍照并記為0 h 結(jié)果；繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后于同一位置觀察并拍照，記為24 h 結(jié)果。劃痕愈合率=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.6.2 Transwell 小室實驗 按照1∶3 比例用培養(yǎng)基稀釋基底膜基質(zhì)，于Transwell 小室中滴加50 μl 稀釋液，迅速鋪勻后放入培養(yǎng)箱中干燥備用。制備含105個/ml 密度的細(xì)胞懸液，滴加200 μl 細(xì)胞懸液到Transwell 小室上室中，加入500 μl 含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基到Transwell 小室下室，將小室放入24 孔板中。靜置培養(yǎng)48 h 后，小室取出后用磷酸鹽緩沖液清洗培養(yǎng)基，用棉簽小心拭去上室中的膠和細(xì)胞，用結(jié)晶紫染液染色下室細(xì)胞10 min，磷酸鹽緩沖液清洗除去染料，于倒置顯微鏡下拍照小室下室處細(xì)胞，隨機挑選5 個視野計算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組IL-6、上皮鈣黏素、神經(jīng)鈣黏素蛋白表達(dá)水平比較

Western blot 檢測結(jié)果顯示，雙歧桿菌組上皮鈣黏素蛋白表達(dá)水平高于對照組，IL-6、神經(jīng)鈣黏素蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

2.2 兩組免疫熒光分析結(jié)果

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，標(biāo)記有Cy3 紅熒光的IL-6、上皮鈣黏素和神經(jīng)鈣黏素蛋白定位于細(xì)胞膜上，與對照組比較，雙歧桿菌組上皮鈣黏素?zé)晒饷黠@，IL-6、神經(jīng)鈣黏素?zé)晒馕⑷酢Ｒ妶D2。

2.3 兩組細(xì)胞劃痕試驗和Transwell 小室實驗結(jié)果比較

24 h 后，兩組均發(fā)生劃痕愈合現(xiàn)象，定量分析結(jié)果顯示雙歧桿菌組劃痕愈合率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。Transwell 小室實驗結(jié)晶紫染色及定量分析結(jié)果顯示雙歧桿菌組侵襲細(xì)胞數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖4。

3 討論

腸道菌群可參與免疫應(yīng)答和維持內(nèi)環(huán)境，其失調(diào)常引起腸道微環(huán)境改變，如腸道慢性炎癥的形成，并且腸道炎癥微環(huán)境中的多種促炎性細(xì)胞因子，如IL-6、腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化細(xì)胞因子-β 等，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但具體機制少見到深入研究[9-11]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 與雙歧桿菌共培養(yǎng)后，其IL-6 蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示雙歧桿菌可抑制HCT116 細(xì)胞的IL-6 分泌，與以往研究類似[12]。張迎娣等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采用雙歧桿菌喂養(yǎng)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠，可減輕其急性期腸道炎癥反應(yīng)，改善腸道炎癥微環(huán)境。李小偉[14]研究表明，雙歧桿菌口服膠囊可減輕結(jié)直腸患者術(shù)后炎癥反應(yīng)，其機制可能與雙歧桿菌能改善腸道微環(huán)境有關(guān)。本研究顯示，雙歧桿菌下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的IL-6 蛋白水平，提示雙歧桿菌可能具有減輕結(jié)腸癌腸道炎癥反應(yīng)的作用。

目前研究表明，多數(shù)上皮細(xì)胞癌在侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了EMT，包括肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等[15-18]。腫瘤炎癥微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞通過一系列程序促使IL-6 等的釋放，相應(yīng)的促炎性細(xì)胞因子可激活EMT的信號通路靶點，啟動腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生[19-21]。結(jié)腸癌是炎癥相關(guān)腫瘤，慢性炎癥是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[22-23]。Dehai 等[24]發(fā)現(xiàn)將肺腺癌細(xì)胞與M2 巨噬細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)后，IL-6 表達(dá)顯著上升，且IL-6 可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞EMT 發(fā)生，介導(dǎo)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，提示IL-6 與EMT 密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，雙歧桿菌與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，IL-6 表達(dá)下降，同時EMT 上皮標(biāo)志物上皮鈣黏素顯著上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物神經(jīng)鈣黏素表達(dá)下調(diào)，伴隨HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著下降，提示雙歧桿菌可通過調(diào)節(jié)IL-6 分泌，抑制EMT 生物標(biāo)志物表達(dá)和效應(yīng)發(fā)生。王偉杰等[25]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌完整肽聚糖可抑制EMT 進(jìn)程，減弱結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，與本研究結(jié)果基本一致。因此雙歧桿菌可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，抑制EMT 進(jìn)程，降低HCT116 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

綜上，本研究在體外實驗中發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可通過下調(diào)IL-6 表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)和EMT，減弱HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，為臨床結(jié)腸癌治療提供新的思路，但不足之處在于未對雙歧桿菌組雙歧桿菌處理的進(jìn)一步優(yōu)化，同時缺少動物實驗研究。