于晴 劉煜敏

(1深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518000；2武漢大學(xué)附屬中南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

阿爾茨海默病(AD)為記憶、認(rèn)知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，老年斑沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元大量丟失是其主要病理特點(diǎn)〔1〕。全球每年用于AD的治療費(fèi)用高達(dá)數(shù)千億美元，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)〔2〕。目前臨床治療AD的藥物主要有抗氧化劑、雌激素、降脂藥、腦代謝改善藥、非甾體抗炎藥、鈣離子拮抗劑及膽堿酯酶抑制劑等，但這些藥物副作用多、價(jià)格昂貴、靶點(diǎn)單一且治療效果難以令人滿意〔3〕。因此，開發(fā)低毒副作用、價(jià)格低廉、多靶點(diǎn)且療效好的AD治療藥物具有重要意義。

川陳皮素為多甲氧基黃酮類化合物，是陳皮的有效成分之一，具有降血糖、抗心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多方面藥理作用〔4〕。近年來(lái)，川陳皮素對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療也逐漸引起了研究人員的關(guān)注〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)〔6〕，川陳皮素能夠通過(guò)減少半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12蛋白表達(dá)，上調(diào)海馬CA1區(qū)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)、血紅素氧合酶(HO)-1表達(dá)，增強(qiáng)抑制凋亡和抗氧化應(yīng)激作用而改善糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。川陳皮素也可以上調(diào)腦啡肽酶表達(dá)及降低腦組織β淀粉樣蛋白(Aβ)水平，進(jìn)而改善AD引起的學(xué)習(xí)、記憶障礙〔7〕。在轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中，川陳皮素治療有助于降低海馬組織Aβ含量及纖維纏結(jié)〔8〕。但迄今為止，川陳皮素對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用未見報(bào)道，故本研究采用川陳皮素干預(yù)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，探討其保護(hù)作用及潛在機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)AD的新治療方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 川陳皮素(成都普瑞法公司)，純度≥95.0%。Aβ25～35(美國(guó)Sigma公司)，純度≥98.0%；Aβ25～35溶解于無(wú)菌蒸餾水中配成1 mmol/L儲(chǔ)備液，在37℃下放置7 d使其老化，保存于-20℃冰箱內(nèi)備用。四甲基噻唑藍(lán)(MTT)測(cè)定試劑盒(杭州聯(lián)科美訊生物公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(泉州睿信生物公司)；TRIzol及qPCR測(cè)定試劑盒(日本Takara公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰基熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及磷酸化mTOR(p-mTOR)多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.2細(xì)胞株 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞(美國(guó)ATCC生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心)。

1.3儀器 DMILHC倒置相差顯微鏡，德國(guó)徠卡公司；QuantStudio 3實(shí)時(shí)定量qPCR系統(tǒng)，美國(guó)賽默飛公司；MuttiSkan Mk3酶標(biāo)儀，芬蘭Labsystem公司；Canpo-2流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；小型迷你伯樂(lè)電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率 在飽和濕度、5% CO2及37℃條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化離心后計(jì)數(shù)，并用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml。設(shè)正常對(duì)照組、Aβ25～35損傷組及川陳皮素25、50、100 μmol/L組，培養(yǎng)2 h后，Aβ25～35損傷組及川陳皮素25、50、100 μmol/L組均加入終濃度為25 μmol/L的Aβ25～35，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，通過(guò)MTT法測(cè)定562 nm處吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5氧化應(yīng)激水平及抗氧化能力測(cè)定 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于6孔培養(yǎng)板中，2×105個(gè)/孔。分組及處理方法同“1.4”，4 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH活性。各組細(xì)胞加100 μl裂解液后，在冰上充分裂解30 min，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，按試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞GSH-Px、CAT活性及MDA含量。

1.6流式細(xì)胞法測(cè)定凋亡率 收集各組細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，在避光、室溫下先加入Annexin V-FITC，孵育10 min；同樣條件下，再加入PI，繼續(xù)孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.7實(shí)時(shí)定量qPCR法測(cè)定mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Primer Bank公布的基因序列設(shè)計(jì)qPCR所需引物，Bcl-2：上游5'-GGGAGAACAGGGTACGATAA-3'，下游5'-CCACCGAACTCAAAGAAGG-3'；Bax：上游5'-TGTCCCGAAGGAGGTTTATT-3'，下游5'-TGT CCCGAAGGAGGTTTATT-3'；β-actin：上游5'-TGAACACGGCATTGTCACCAACTGG-3'，下游5'-ACTTGCGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3'。常規(guī)方法進(jìn)行qPCR，根據(jù)實(shí)時(shí)定量qPCR擴(kuò)增曲線，按照2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8Western印跡法測(cè)定蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，分別加100 μl裂解液后，在冰上充分裂解30 min，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定總蛋白濃度。吸取上清液10 μl，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h。用PBS沖洗，分別加入Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR多克隆抗體，室溫下放置2 h。再用PBS沖洗，加入二抗，室溫下繼續(xù)放置1 h，顯色。采用凝膠圖像處理系統(tǒng)，觀測(cè)目的蛋白Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的光密度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1川陳皮素保護(hù)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷 與正常對(duì)照組比較，Aβ25～35損傷組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與Aβ25～35損傷組比較，川陳皮素各濃度處理組細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，Aβ25～35損傷組SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性顯著增加(P<0.05)；與Aβ25～35損傷組比較，川陳皮素各濃度處理組LDH活性顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率、LDH、GSH-Px、CAT、MDA水平比較

2.2川陳皮素減少Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 與正常對(duì)照組〔(5.49±0.68)%〕比較，Aβ25～35損傷組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率〔(30.71±3.09)%〕顯著增加(P<0.05)；川陳皮素25、50、100 μmol/L組〔(25.63±2.03)%、(14.88±1.81)%、(11.20±1.24)%〕與Aβ25～35損傷組比較顯著降低(P<0.05)，見圖1。

2.3川陳皮素降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激水平 與正常對(duì)照組比較，Aβ25～35損傷組SH-SY5Y細(xì)胞GSH-Px、CAT活性明顯降低，而MDA含量顯著增加(P<0.05)；與Aβ25～35損傷組比較，川陳皮素各濃度處理組SH-SY5Y細(xì)胞GSH-Px、CAT活性均呈不同程度增加，而MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4川陳皮素調(diào)控Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，Aβ25～35損傷組Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax值明顯降低(P<0.05)，而Bax mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；給予不同濃度川陳皮素處理后，與Aβ25～35損傷組比較，SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax值顯著增加(P<0.05)，而Bax mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 川陳皮素對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax值的影響

2.5川陳皮素激活A(yù)β25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Akt/mTOR通路 與正常對(duì)照組比較，Aβ25～35損傷組SH-SY5Y細(xì)胞p-Akt及p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；不同濃度川陳皮素處理后，與Aβ25-35損傷組比較，SH-SY5Y細(xì)胞p-Akt及p-mTOR蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見圖2，表3。

1～5：正常對(duì)照組、Aβ25～35損傷組、25 μmol/L川陳皮素組、50 μmol/L川陳皮素組、100 μmol/L川陳皮素組圖2 川陳皮素對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Akt/mTOR通路的影響

表3 川陳皮素對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Akt/mTOR通路的影響

3 討 論

Aβ是由β淀粉樣蛋白前體蛋白(β-APP)的異常代謝而生成的具有β折疊結(jié)構(gòu)的淀粉樣肽段，可以在神經(jīng)元外聚集成Aβ寡聚體〔9〕。Aβ寡聚體可以直接破壞離子通道進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)生聚集，也可以與細(xì)胞膜表面的多種受體結(jié)合激活胞內(nèi)信號(hào)通路，使細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化、升高活性氧、線粒體功能紊亂等損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔10〕。Aβ25～35為人工合成的Aβ活性片段，具有與Aβ1～42相似的生物學(xué)活性，常用于建立AD的體外與體內(nèi)模型〔11〕。本研究結(jié)果提示川陳皮素對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

在眾多的AD發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注?？寡趸到y(tǒng)功能紊亂和自由基水平升高可能導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，進(jìn)而形成AD的病理變化〔12〕。Aβ可以介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中活性氧簇(ROS)大量生成，如不能及時(shí)清除，ROS會(huì)攻擊神經(jīng)細(xì)胞膜，損害神經(jīng)細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)并造成細(xì)胞的凋亡或死亡〔13〕?？寡趸锟梢宰柚够蛳齊OS生成，緩解神經(jīng)細(xì)胞退化，如具有清除自由基作用的褪黑激素，可以顯著抑制膠質(zhì)細(xì)胞的異常活化和Aβ的沉積，進(jìn)而改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力〔14〕。本研究結(jié)果表明川陳皮素保護(hù)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用與降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

神經(jīng)元凋亡是AD的病理特征之一，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量的顯著減少；Aβ對(duì)神經(jīng)元具有強(qiáng)烈的毒性，能夠?qū)е律窠?jīng)元凋亡〔15〕。本研究結(jié)果提示川陳皮素具有抗Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡作用。神經(jīng)元凋亡過(guò)程受到胞內(nèi)的同源異二聚體蛋白Bax和Bcl-2調(diào)控，前者促進(jìn)細(xì)胞凋亡，后者抗細(xì)胞凋亡，二者的比例決定細(xì)胞的凋亡進(jìn)程〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)〔17〕，人參總蛋白可抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明川陳皮素保護(hù)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用與抗凋亡作用有關(guān)。

Akt/mTOR通路是一條重要的細(xì)胞存活信號(hào)通路，參與神經(jīng)細(xì)胞增殖與凋亡過(guò)程〔18〕。Akt是原癌基因c-Akt的表達(dá)產(chǎn)物，處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，其激活受PI3K調(diào)控，是神經(jīng)元存活、突觸間信息傳遞、突觸結(jié)構(gòu)形成、軸突及樹突形成、神經(jīng)和血管新生所必需〔19〕。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷時(shí)，活化的Akt可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受Aβ蛋白等氧化性毒物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要〔20〕。mTOR可以由Akt直接活化，在神經(jīng)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)及凋亡中同樣扮演重要的角色〔21〕。本研究結(jié)果提示川陳皮素保護(hù)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用與活化Akt/mTOR通路有關(guān)。

綜上，川陳皮素對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，該保護(hù)作用與調(diào)控Akt/mTOR通路抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡有關(guān)，但具體機(jī)制還有待于深入研究。