孫毅，潘持國，孫麗麗，李猛，張娣，張凱齊，李超

本研究發(fā)現(xiàn)及改進：

通過針對聽力障礙患者進行遺傳性失聰基因檢測，發(fā)現(xiàn)在山東地區(qū)GJB2基因235delC位點和SLC26A4基因IVS7-2A＞G位點是遺傳性失聰基因發(fā)病率最高的突變位點；按本研究所采用的4個常見致聾基因的15個熱點突變位點的微陣列芯片的檢測方法相對落后，不能提供準(zhǔn)確的臨床基因診斷；因此，后續(xù)研究中應(yīng)系統(tǒng)進行失聰相關(guān)基因的全序列分析，為本地區(qū)失聰基因突變圖譜的繪制提供依據(jù)。

失聰——人和人之間一道無聲的墻，是困擾生活最常見的疾病之一。我國失聰患者超過3 000萬［1］，其中遺傳因素占60%以上［2-3］。近些年，基因檢測技術(shù)的發(fā)展對遺傳性失聰分子病因的闡明起了巨大推動作用，使早診斷、早發(fā)現(xiàn)成為現(xiàn)實，通過對聽力障礙患者進行基因檢測、分析病因，可預(yù)估下一代患病風(fēng)險。但不斷改進的分子診斷技術(shù)一方面可提高檢出率，另一方面也面臨著新檢測技術(shù)帶來的數(shù)據(jù)分析困難和變異解讀的不確定性等問題。因此在聽力障礙患者中開展能明確病因的基因檢測和遺傳咨詢十分必要。研究表明我國失聰患者致病熱點基因有4個［4-5］。本研究利用基因芯片技術(shù)對山東省聽力障礙患者進行4種常見致聾基因的15個突變位點基因檢測，進一步了解山東地區(qū)失聰患者基因突變情況、完善山東省聾病的分子流行學(xué)資料，為聽力殘疾預(yù)防提供參考，進而實現(xiàn)防聾減殘、提高人口素質(zhì)的目的。

1 對象與方法

1.1 研究對象 對2016—2020年參加山東省聽力障礙人士失聰基因檢測項目的5 664例持聽力殘疾證或持聽力診斷證明的聽力障礙患者進行遺傳性失聰基因篩查檢測，＜18歲2 527例，18～30歲2 036例，＞30歲1 101例；男2 106例，女3 558例；持聽力殘疾二級及以上證件者4 429例，持聽力殘疾三級及以下證件者1 183例，余52例持多重殘疾證件。樣本采集前相關(guān)專業(yè)醫(yī)護人員向研究對象簡單介紹聽力檢測及失聰基因檢測，并指導(dǎo)其填寫《檢測人員信息登記表》，包括基本信息、失聰發(fā)病年齡、家族史、耳毒性藥物應(yīng)用史、創(chuàng)傷史等，簽署知情同意書。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意〔倫理審批編號：2021-（3）〕。

1.2 聽力檢測 使用純音測聽法檢測患者聽力，根據(jù)我國2006年第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查診斷標(biāo)準(zhǔn)中的0.5、1、2、4 kHz的聽閾均值進行計算。聽力殘疾一級，平均聽閾≥91 dB HL；聽力殘疾二級，平均聽閾81～90 dB HL；聽力殘疾三級，平均聽閾61～80 dB HL；聽力殘疾四級，平均聽閾41～60 dB HL。

1.3 失聰基因檢測方法 對聽力障礙人士進行15項遺傳性失聰檢測，采用博奧晶典核酸提取試劑盒（貨號：360100-01）提取外周血基因組DNA，使用擴增儀對目的基因片段進行擴增，最后使用博奧晶典生物技術(shù)有限公司LuxScanTM 10K-A微陣列芯片掃描儀對檢測結(jié)果進行自動判讀。每次檢測均包含陰性和陽性對照，以驗證芯片檢測結(jié)果的可靠性。檢測結(jié)束后，對所有芯片陽性結(jié)果進行Sanger測序復(fù)核，同時隨機抽取5%的陰性結(jié)果樣本進行Sanger測序。

1.4 遺傳咨詢方案 通過基因檢測結(jié)果對已知的遺傳方式和突變位點進行相應(yīng)的解讀說明，并給予患者生活指導(dǎo)卡和用藥指導(dǎo)卡；對于有生育需求的患者給予生育風(fēng)險指導(dǎo)卡，告知生育風(fēng)險或再生育風(fēng)險，開展遺傳咨詢，從而減少失聰兒出生。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聽力檢測情況 5 664例聽力障礙患者中，聽力殘疾一級3 891例，聽力殘疾二級1 463例，聽力殘疾三級188例，聽力殘疾四級73例，其余49例（小耳畸形38例，外耳道封閉11例）。

2.2 失聰基因檢測情況 5 664例聽力障礙患者檢測出失聰基因突變2 503例（44.19%），分別為GJB2基因突變1 227例（21.66%），確診致病突變691例（12.20%）；SLC26A4基因突變975例（17.21%），確診致病404例（7.13%）；線粒體12SrRNA基因突變97例（1.71%）；GJB3基因突變158例（2.79%）；雙基因雜合突變46例（0.81%）。顯示基因結(jié)果正常3 161例，未發(fā)現(xiàn)攜帶致聾基因，詳見表1～3。

表1 5 664例聽力障礙患者的GJB2基因檢測情況（n=5 664）Table 1 Genetic testing for GJB2 gene mutations in 5 664 hearingimpaired patients

表2 5 664例聽力障礙患者SLC26A4基因檢測情況（n=5 664）Table 2 Genetic testing for SLC26A4 gene mutations in 5 664 hearingimpaired patients

表3 5 664例聽力障礙患者其他基因檢測情況（n=5 664）Table 3 Genetic testing for mutations in mitochondrial 12S rRNA gene，GJB2+ SLC26A4 genes，and GJB3 gene in 5 664 hearing-impaired patients

2.3 不同基因在失聰聽力等級中例數(shù)的分布情況 GJB2、SLC26A4基因突變在聽力等級中比較一致，屬于熱點突變，而12rRNA、GJB3和雙基因突變在聽力等級中分布差別很大，見表4。攜帶GJB2基因、攜帶SLC26A4基因突變患者聽力一級、二級分布情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表4 不同失聰基因在失聰聽力等級中例數(shù)分布情況Table 4 Number of hearing-impaired patients carrying mutations in each of the four common genes related to hereditary deafness or double heterozygous mutations by the grade of hearing disability

表5 GJB2、SLC26A4基因變異患者聽力一、二級分布〔n（%）〕Table 5 Prevalence of GJB2 and SLC26A4 gene mutations in hearingimpaired patients by the grade of hearing disability

3 討論

失聰是最常見的出生缺陷之一，發(fā)病率高，異質(zhì)性明顯，在我國聽力殘疾患者數(shù)量位居各類殘疾之首［6］，約占殘疾人群的33.5%［7］。遺傳性失聰分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X或者Y連鎖和線粒體突變母系遺傳4種遺傳方式，70%的遺傳性失聰是以失聰為唯一的癥狀，不伴有其他臨床表現(xiàn)或疾病的非綜合征性失聰［8-10］。

本研究中的5 664例聽力殘疾患者經(jīng)本院聽力檢測定級結(jié)果存在差異，經(jīng)討論交流發(fā)現(xiàn)可能是因為檢測設(shè)備，檢測環(huán)境和操作人理論知識儲備不足造成的［11］。因此基層聽力設(shè)備更新?lián)Q代、聽力測試環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)、聽力評估方法統(tǒng)一、聽力評估人才規(guī)范化培養(yǎng)等急需國家統(tǒng)籌解決。

本研究使用15項遺傳性失聰基因篩查微陣列芯片，對山東5 664例持證的聽力障礙患者進行基因檢測。微陣列基因芯片技術(shù)，其基本原理是分子雜交，即通過特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針，將樣本通過 PCR 擴增進行熒光標(biāo)記，然后與芯片探針按堿基配對的原則進行雜交，最后通過自動化儀器檢測雜交或反應(yīng)信號的強度，從而得出基因表達或突變的信息。本研究使用博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的中國人群中高發(fā)致病的4個基因15個突變位點檢測芯片，這種芯片每次可以同時檢測四個患者，可同時平行檢測多張芯片，具有通量高、檢測速度快、自動化程度快等優(yōu)勢。本研究的檢出率為44.19%，可滿足聽力障礙患者臨床失聰基因檢測的需求。但是本方法只能檢測已知的致病基因，無法發(fā)現(xiàn)未知的遺傳性失聰突變個體，易造成漏診，應(yīng)謹慎解釋檢測結(jié)果［12］。本研究中檢測到2 503例攜帶失聰相關(guān)致聾基因突變，其中1 227例發(fā)生GJB2基因突變，975例發(fā)生SLC26A4基因突變，而這兩個基因也是最主要的致病基因，與全國失聰人群檢測統(tǒng)計一致［13-15］。GJB2基因位于人類13號染色體上，含有2個外顯子，其中，235delC突變位點在GJB2基因的攜帶率為85.00%，是本研究聽力障礙患者中最常見的致病突變位點，與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致［16］。SLC26A4基因又稱PDS基因，位于人類7號染色體，含有21個外顯子，IVS7-2A＞G位點突變在SLC26A4基因，攜帶率為78.56%，亦是本研究聽力障礙患者中僅次于GJB2基因235delC位點的第二熱點致病突變，是SLC26A4基因的最高致病突變［17］。線粒體12SrRNA基因突變97例，只要檢測到該突變存在，不論均質(zhì)還是異質(zhì)突變，均提示患者對氨基糖苷類抗生素敏感，需防止 “一針致聾”的悲劇發(fā)生［18-19］。研究中還檢測到GJB3基因c.538C＞T位點突變158例，其遺傳方式可為常染色體隱性遺傳或顯性遺傳，在不同性別表現(xiàn)異質(zhì)性［20-21］。對于顯性遺傳性失聰檢測，還要注意失聰發(fā)生存在遲發(fā)性和失聰外顯不全等情況［22］。

對失聰患者的基因檢測，可以使患者或家屬了解遺傳性失聰?shù)陌l(fā)病情況，采取針對性的婚育指導(dǎo)，降低聾病對家庭的影響［23-25］。失聰基因檢測一般包括檢測前的咨詢問診和檢測后的遺傳咨詢，通過檢測前的咨詢問診可以判定聾病的性質(zhì)、聽力損失變化情況、遺傳家族史、致聾因素及發(fā)生時間等［20，26］，而通過基因檢測可以明確致聾原因。

聾-聾同證婚配是我國失聰人群最常見的婚配方式，目前我國婚齡段聽力殘疾人群在殘疾人相關(guān)企業(yè)中呈同證聚集狀態(tài)或與其他類殘疾人聚集狀態(tài)，對失聰者及其配偶進行聾病易感基因檢測和干預(yù)可減少下一代聾兒的出生，提升人口素質(zhì)［27］。在失聰患者基因檢測病因分析過程中，臨床表型必須與基因檢測結(jié)果一同分析。對于單純進行婚育指導(dǎo)的患者務(wù)必明確其是否有家族史、是否有相同臨床癥狀和相同致聾基因突變。對于常見的GJB2或者SLC26A4基因檢查未通過者，配偶應(yīng)進行基因檢測以及進一步的產(chǎn)前診斷或植入前診斷，以預(yù)防新生兒聽力殘疾發(fā)生［28-29］。通過對未婚聽力障礙人群失聰基因的檢測，明確遺傳性失聰發(fā)病情況，可避免因兩人攜帶相同致聾基因突變而增加生育聽力障礙患兒的風(fēng)險。本研究使用的芯片法失聰基因檢測覆蓋基因點位少，確診率低。因此，建議未明確病因的患者通過高通量測序檢測，盡可能地明確病因，進而有效阻斷遺傳性失聰基因在失聰家庭中的傳遞［30］。

根據(jù)“健康中國2030”規(guī)劃綱要指示精神及《殘疾預(yù)防和殘疾人康復(fù)條例》要求，各級殘疾人聯(lián)合會和各級康復(fù)醫(yī)院，運用專業(yè)手段定期對聽力損失人群檢測調(diào)查，判定聾病發(fā)展情況，分析致殘原因，實施動態(tài)監(jiān)測，為臨床診斷提供依據(jù)。本研究通過規(guī)范開展遺傳性失聰基因檢測、遺傳咨詢和婚育指導(dǎo)，盡可能揭示山東省聽力殘疾人群病因的同時，積極開展失聰三級疾病預(yù)防，降低失聰患兒的出生率［31］。

綜上所述，隨著醫(yī)療水平的提高，殘疾預(yù)防理念深入人心，經(jīng)過一定周期的遺傳干預(yù)，聽力障礙患者在人群中的比例或許會有很大改善，從根本上降低遺傳性失聰?shù)陌l(fā)病率，將會產(chǎn)生極大的社會和經(jīng)濟效益。

作者貢獻：孫毅進行研究設(shè)計和實施、資料收集整理、撰寫論文并對論文負責(zé)；潘持國、孫麗麗、李猛、張娣、張凱齊進行試驗實施、評估、材料收集；李超進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。