王振國，高育哲，時(shí)家峰，張俊杰，江睿生，霍金杰，蘇 爽，肖志剛

擠壓溫度對(duì)大豆分離蛋白與原花青素復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能特性的影響

王振國，高育哲，時(shí)家峰，張俊杰，江睿生，霍金杰，蘇 爽，肖志剛※

（沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，沈陽 110034）

為了探究不同擠壓溫度（40、60、80、100和120℃）對(duì)大豆分離蛋白（Soy Isolate Protein，SPI）與葡萄籽原花青素（Grape Seed Proanthocyanidin Extract，GSPE）復(fù)合物功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性的影響。該研究以溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性、-電位、粒度為指標(biāo)，利用熒光光譜、紅外光譜分析該復(fù)合體系中大豆分離蛋白功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：相較于擠壓SPI，經(jīng)過擠壓處理的SPI-GSPE復(fù)合物的溶解度、乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性指數(shù)、-電位絕對(duì)值及持水性均顯著提高（<0.05），其表面疏水性、持油性顯著下降（<0.05）。隨著擠壓溫度的升高，SPI-GSPE復(fù)合物的溶解度、持油性及乳化活性均先增大后減小且在80℃達(dá)到最大值，而其表面疏水性先減小后增大且最小值在80℃，-電位絕對(duì)值、乳化穩(wěn)定性及持水性均隨溫度的升高而降低。粒徑分析結(jié)果表明，擠壓處理后SPI與GSPE形成了更加致密的復(fù)合物；熒光光譜及紅外光譜結(jié)果表明，與GSPE的復(fù)合及擠壓處理使SPI氨基酸殘基所處微環(huán)境發(fā)生變化，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。以上結(jié)果表明擠壓溫度為80℃時(shí)SPI-GSPE復(fù)合物功能性質(zhì)提高幅度最大，為GSPE與SPI復(fù)合提高SPI的功能性質(zhì)提供參考。

擠壓；結(jié)構(gòu)特性；功能特性；原花青素；大豆分離蛋白

0 引 言

大豆分離蛋白是一種全價(jià)蛋白，經(jīng)低溫脫脂豆粕加工而成。其主要組分為甘氨酸和-伴球蛋白。甘氨酸由一個(gè)酸性亞基和一個(gè)堿性亞基組成，由一個(gè)二硫鍵連接。-伴球蛋白由′3種亞基構(gòu)成[1]。大豆分離蛋白（Soy Isolate Protein，SPI）具有一系列功能特性，如溶解度、乳化性、持水性等，目前已被廣泛地應(yīng)用于食品加工[2]。原花青素是自然界中發(fā)現(xiàn)的一種多酚，是一類含有雙黃酮衍生物的天然多酚化合物的總稱[3]。葡萄籽原花青素（Grape Seed Proanthocyanidin Extract，GSPE）來源于葡萄籽由黃烷-3-醇通過C-C鍵或CO-C鍵聚合而形成，因其具有的生物活性而被廣泛研究。酚類化合物與蛋白質(zhì)的相互作用可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)發(fā)生變化，如溶解度、熱穩(wěn)定性和乳化性。

目前，蛋白質(zhì)和多酚的復(fù)合作用日益受到重視。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)與多酚之間的復(fù)合作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變。Hasni[4]研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物與蛋白通過親水和疏水相互作用結(jié)合。Relkin等[5]研究表明酚類化合物分散在中性水溶液中會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。在Rawel等[6]研究中發(fā)現(xiàn)酚類化合物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)可引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)。蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子的表面性質(zhì)受到影響，使其具有親水性。Tsai等[7]觀察到超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）與酚類化合物相互作用后熱穩(wěn)定性增加，并且隨著加工溫度的提高兩者結(jié)合能力越強(qiáng)。

擠壓技術(shù)是一種物理改性技術(shù)，它集成了多個(gè)單元操作，如物料混合、均質(zhì)化、蒸煮和成型[8]。它具有改善食品材料功能特性的能力。分子變化的激活和化學(xué)鍵的建立導(dǎo)致功能特性的改變。在擠壓過程中，蛋白質(zhì)通過機(jī)械和熱能的協(xié)同作用，失去了其固有的、有組織的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[9]，其構(gòu)象發(fā)生變化。盡管擠壓技術(shù)在工業(yè)上已經(jīng)成熟使用，但是擠壓對(duì)蛋白質(zhì)功能性的研究及應(yīng)用尚未得到充分理解。目前食品營養(yǎng)成分相互作用引起了研究者的廣泛關(guān)注，但是對(duì)于多酚與蛋白相互作用的研究主要集中在濕熱條件下，且鮮見涉及在擠壓體系下多酚與蛋白的相互作用。同時(shí)考慮到蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)對(duì)人類健康、食品營養(yǎng)和質(zhì)量等方面的重要作用。因此本試驗(yàn)探究了在擠壓體系內(nèi)擠壓溫度對(duì)大豆分離蛋白與葡萄籽原花青素復(fù)合物（Soy Isolate Protein -Grape Seed Proanthocyanidin Extract，SPI-GSPE）的溶解性、乳化活性、持水性等功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，以期了解兩者之間相互作用后功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的變化，拓寬大豆蛋白食品的應(yīng)用范圍（如植物基素肉），為生產(chǎn)功能型SPI-GSPE復(fù)合產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原花青素，蘇州天恒生物；大豆分離蛋白，哈爾濱高科技術(shù)有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、Tris、甘氨酸冰乙酸、8-苯氨基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-Naphthalenesulfonic Acid，ANS）、濃鹽酸，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulphate，Ammonium Persulfate，SDS），麥克林化學(xué)試劑有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；小型超微粉碎機(jī)，廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；ULTRA TURRAX?高速分散機(jī)及磁力攪拌器，德國IKA公司；UV1800-型紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90分子粒度和Zeta電位分析儀，英國Malvern公司；分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。DS56-Ⅲ雙螺桿擠出機(jī),濟(jì)南賽信膨化機(jī)械有限公司；BT-100SD電磁加水泵，中國上海嘉鵬科技有限公司；冷凍干燥機(jī)，松原華興科技發(fā)展有限公司；AVATAR 370FT-IR 紅外光譜儀，德國布魯克公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

擠壓試驗(yàn)在雙螺桿食品擠壓機(jī)中進(jìn)行，如圖1所示。將SPI與 GSPE按質(zhì)量比（w/w）為16:1（4%）制備基料，對(duì)該基料及天然SPI分別在5種不同的擠壓溫度下進(jìn)行處理：40、60、80、100、120 ℃，雙螺桿擠出機(jī)的擠出參數(shù)設(shè)置為：進(jìn)料速度8 kg/h，螺桿速度250 r/min。采用電磁加水泵以8.54 L/h的輸入速率向擠壓機(jī)中加水，并使各桶區(qū)含水率保持在55%。擠出機(jī)有10個(gè)獨(dú)立的加熱區(qū)。在本試驗(yàn)中，第一區(qū)至第五區(qū)機(jī)筒溫度保持25 ℃不變，采用五區(qū)進(jìn)料，將第六至第十區(qū)筒體擠壓溫度同時(shí)設(shè)置為40、60、80、100、120 ℃。擠壓后獲得5種擠壓溫度的試樣，在冷凍干燥機(jī)中凍干18 h，并研磨過80目篩（直徑=0.178 mm）進(jìn)行下一步試驗(yàn)（以上擠壓機(jī)參數(shù)及多酚添加量均根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)所得）。

1.3.2 SPI、SPI-GSPE復(fù)合物指標(biāo)的測定

1）溶解度的測定

配置0.01g/mL蛋白溶液10 mL并通過磁力攪拌1.5 h，然后在7 000 r/min離心20 min，通過雙縮脲法測得上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量。蛋白質(zhì)的溶解度按下式計(jì)算：

1.發(fā)動(dòng)機(jī) 2.變速箱 3.喂料口 4.注水口 5.螺桿 6.加熱區(qū) 7.模頭區(qū)

1.Motor 2.Gearbox 3.Feeding zone 4.Water filling nozzle 5.Screw 6.Heating zone 7.Die zone

圖1 擠壓機(jī)示意圖

Fig.1 Schematic diagram of extruder

2）乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法稍作修改，配置2 mg/mL SPI溶液30 mL，加入10 mL大豆油混勻。使用高速分散機(jī)在10 000r/min轉(zhuǎn)速下均質(zhì)1min后，立即和10 min后取溶液底部的40L乳液，將其加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% SDS溶液中，混合均勻，使用分光光度計(jì)測定波長為500 nm處的吸光值，分別記為0和1。乳化活性指數(shù)（Emulsifying Activity Index，EAI）及乳化穩(wěn)定性指數(shù)（Emulsion Stability Index，ESI）按下式計(jì)算：

式中為稀釋倍數(shù)；為油脂占總數(shù)的比例；為光路長度，cm；C為蛋白質(zhì)濃度，g/mL；0為初始吸光值；為間隔時(shí)間，min；為吸光度差值。

3）持水性的測定

采用文獻(xiàn)[11]的方法稍加修改，配置20 mg/mL SPI溶液10 mL，蛋白與離心管總質(zhì)量記為1（g）。渦旋震蕩1 min后進(jìn)行7 000 r/min離心10 min，用濾紙將離心管上層的水吸出，離心管及剩余沉淀總質(zhì)量記為2（g）。持水性按下式計(jì)算：

4）粒度及-電位

用去離子水配置10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的蛋白溶液，磁力攪拌0.5 h，通過分子粒度儀及Zeta電位分析儀對(duì)蛋白粒度大小分布及-電位進(jìn)行測定。

5）表面疏水性

依據(jù)Shi等[12]的方法并適當(dāng)修改，8 mmol/L ANS貯備液和10 mg/mL蛋白溶液均用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，p H值7.0）制備。蛋白溶液在8 000 r/min離心10 min，蛋白濃度按梯度稀釋為0.005～0.500 g/L之間，將50L ANS與5 mL多酚蛋白混合物溶液混合均勻。設(shè)置熒光光譜的測定條件：激發(fā)波長及發(fā)射波長分別設(shè)為390 nm和470 nm，狹縫5 nm，掃描速率20 nm/s。表面疏水性指數(shù)是通過計(jì)算熒光指數(shù)相對(duì)于蛋白濃度的初始斜率而獲得的。

6）持油性的測定

采用文獻(xiàn)[13]的方法并加以修改，稱取0.1 g大豆分離蛋白裝入50 mL離心管中，離心管及蛋白總質(zhì)量記為1（g）。向離心管中加入5 mL的色拉油，充分混合均勻后，在4 000 r/min離心15 min，將上層清液倒出，并將附著在離心管壁內(nèi)外的所有油滴擦拭干凈后，記錄此時(shí)離心管及剩余沉淀的總質(zhì)量為2（g）。持油性按以下公式計(jì)算：

7）二級(jí)結(jié)構(gòu)的測定

將完全干燥的樣品與溴化鉀粉末按照1:100的比例均勻混合后，經(jīng)瑪瑙研缽研磨后進(jìn)行壓片處理，光譜記錄在400～4 000 cm-1的范圍內(nèi)，掃描次數(shù)32次。使用Peakfit Version 4.12 軟件進(jìn)行分析，對(duì)酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）處進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，計(jì)算蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

8）熒光光譜的測定

使用熒光分光光度計(jì)對(duì)蛋白的熒光光譜進(jìn)行測定。將蛋白進(jìn)行適當(dāng)稀釋。設(shè)置熒光光譜的測定條件：激發(fā)波長及掃描波長分別為290 nm，300～500 nm，狹縫寬為5 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，PeakFit v4.12軟件進(jìn)行紅外擬合，Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解度

溶解度是蛋白質(zhì)最重要的性質(zhì)之一，它對(duì)其他功能特性有直接影響。表1為擠壓溫度（40、60、80、100和120 ℃）對(duì)SPI及SPI-GSPE復(fù)合物溶解度的影響。擠壓后SPI的溶解度顯著降低（<0.05）。這可能是由于蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)之間熱誘導(dǎo)形成不溶性聚集體[14]。當(dāng)擠壓溫度從40 ℃升至80 ℃時(shí)，SPI及SPI-GSPE溶解度均增加。這可能是由于蛋白質(zhì)在擠壓機(jī)作用下，蛋白質(zhì)分子展開及二硫鍵的斷裂使蛋白質(zhì)與水的相互作用增強(qiáng)。80 ℃后，SPI及SPI-GSPE溶解度均顯著降低（<0.05），這可能是由于SPI中的蛋白組分在高溫高壓高剪切的處理下，甘氨酸的堿性亞基與-伴球蛋白的-亞基之間形成了難以溶解的聚集體，這降低了蛋白的溶解度。Silva等[15-16]也有相關(guān)研究也得出類似結(jié)論。

表1 不同擠壓溫度下SPI及SPI-GSPE復(fù)合物溶解度

注：樣品1為大豆分離蛋白（Soy Isolate Protein，SPI）。樣品2為大豆分離蛋白與葡萄籽原花青素復(fù)合物（Soy Isolate Protein -Grape Seed Proanthocyanidin Extract，SPI-GSPE）。字母a、b、c…為不同擠壓溫度下及未擠壓SPI或SPI-GSPE顯著性分析結(jié)果，*為擠壓后SPI及SPI-GSPE復(fù)合物組間有顯著差異（<0.05）（下同）

Note: Sample 1 was Soy Isolate Protein (SPI). Sample 2 was Soy Isolate Protein-Grape Seed Proanthocyanidin Extract (SPI-GSPE).The letters a, b, c... is the significant analysis results of SPI or SPI-GSPE at different extrusion temperatures and without extrusion, * is the difference between groups of SPI and SPI-GSPE complex after extrusion (<0.05) (the same below).

由表1可知，不同溫度下，較擠壓SPI，SPI-GSPE復(fù)合物蛋白溶解度顯著提高（<0.05）。這可能是由于GSPE與SPI疏水基團(tuán)作用，且原花青素分子上的羥基一部分與水形成氫鍵，間接增強(qiáng)了大豆分離蛋白的水合作用，故而在一定程度上增大了溶解度。胡湘蜀[17]也報(bào)道了茶多酚可提高SPI的溶解性。

2.2 乳化性

乳化活性指數(shù)(Emulsifying Activity Index，EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(Emulsion Stability Index，ESI)分別代表了蛋白質(zhì)在油水界面形成和穩(wěn)定乳化液的能力，這對(duì)各種傳統(tǒng)食品和新型食品的開發(fā)至關(guān)重要。由圖2可知，擠壓后SPI及SPI-GSPE復(fù)合物的EAI高于未擠壓SPI。隨擠壓溫度的增加，SPI的EAI增加。SPI-GSPE復(fù)合物的EAI在擠壓溫度40～80 ℃隨著溫度的升高而增加。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)雖經(jīng)過擠壓后溶解度下降，但是乳液制備過程中均質(zhì)施加的機(jī)械力破壞了分子間相互作用，并暴露了蛋白質(zhì)表面下的疏水基團(tuán)。蛋白質(zhì)表面活性得到了提高，從而導(dǎo)致EAI的提升[18]。此后隨著溫度的升高（80～120 ℃），SPI-GSPE復(fù)合物EAI降低，這可能是由于GSPE在高溫下部分降解，從而導(dǎo)致其EAI下降。李明月[19]研究表明，過高的溫度可使原花青素氧化聚合從而導(dǎo)致其含量降低。

注：大寫字母A、B、C…為不同擠壓溫度下SPI-GSPE顯著性分析結(jié)果（下同）（P<0.05）。

由圖2可知，擠壓SPI的ESI高于未擠壓SPI，這可能是由于擠壓及均質(zhì)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)造成破壞而暴露出的疏水基與油性物質(zhì)交聯(lián)可形成脂肪球，而親水基和水分子結(jié)合包裹在脂肪球表面可以提高乳液的穩(wěn)定性。隨著溫度的提高，SPI及SPI-GSPE復(fù)合物ESI顯著降低(< 0.05)且擠壓SPI于100℃后低于未擠壓蛋白，這可能是因?yàn)闊崮茌斎牒蜋C(jī)械剪切破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和展開，從而形成小分子肽和游離氨基酸[20]。已知較小的肽在穩(wěn)定乳液方面的效率較低，因?yàn)橛捎陔姾膳懦夂捅砻媸杷?，肽可能不容易團(tuán)聚產(chǎn)生脂肪球膜。擠壓過程中形成的較小肽被認(rèn)為是ESI降低的主要原因。

由圖2所示，SPI的EAI和ESI均通過與GSPE結(jié)合而顯著增加（<0.05），這可能是由于SPI與GSPE結(jié)合后，蛋白的構(gòu)象和界面行為發(fā)生了改變。Karefyllakis等[21]也發(fā)現(xiàn)，酚類化合物對(duì)蛋白質(zhì)的界面和乳化特性有積極的影響。這可能是由于隨著GSPE的加入，界面膜的表面壓力和粘彈性被增強(qiáng)，導(dǎo)致界面膜更加穩(wěn)定，從而增加了SPI-GSPE復(fù)合物的EAI及ESI。

2.3 表面疏水性

表面疏水性定義為非極性基團(tuán)與極性溶液在蛋白質(zhì)表面接觸的數(shù)量。未擠壓SPI的表面疏水性指數(shù)（0）（<0.05）顯著低于擠壓SPI（圖3）。這可能是由于擠壓過程中，SPI在高壓和高剪切力作用下暴露出一些疏水性氨基酸殘基，從而導(dǎo)致其表面疏水性增加[22]。隨著擠壓溫度的升高，0先降低后升高，這可能是由于擠壓時(shí)蛋白質(zhì)通過疏水相互作用而聚集，從而使疏水點(diǎn)大部分被限制在聚集物內(nèi)部。在80 ℃達(dá)到最低值，之后隨著溫度的升高而升高。這一趨勢反映了在較高溫度條件下，擠壓過程可能導(dǎo)致聚集物或蛋白質(zhì)發(fā)生部分解離現(xiàn)象。如圖3所示，不同溫度下，SPI-GSPE復(fù)合物的0值相較于SPI顯著降低（<0.05）。這可能是由于GSPE與SPI的相互作用引起了蛋白的結(jié)構(gòu)改變，蛋白內(nèi)部的部分親水區(qū)域暴露，從而導(dǎo)致蛋白的疏水性降低。Nguela等[23]研究中也有相似結(jié)論。

2.4　擠壓熱處理對(duì)SPI-GSPE復(fù)合物ζ-電位的影響

-電位代表了蛋白質(zhì)分散穩(wěn)定性，其絕對(duì)值越高表明該體系越穩(wěn)定。所有樣品的-電位（表面電荷）值如圖4所示，擠壓處理顯著降低了SPI表面電荷絕對(duì)值（<0.05），且隨著溫度的升高而降低；這表明SPI在擠壓過程中發(fā)生的變性導(dǎo)致了分子表面負(fù)電荷基團(tuán)的減少，從而降低了-電位絕對(duì)值。除120 ℃外，隨著GSPE的加入，蛋白的-電位絕對(duì)值顯著提高（<0.05），表明SPI和GSPE形成了表面有更多的陰離子基團(tuán)的復(fù)合物，SPI-GSPE具有較強(qiáng)的物理穩(wěn)定性，因?yàn)镾PI與GSPE之間較強(qiáng)的靜電斥力會(huì)抑制它們的聚集和沉降[24]。

2.5 粒徑

蛋白質(zhì)粒徑的大小對(duì)蛋白功能性質(zhì)至關(guān)重要。圖5表明，經(jīng)過擠壓處理后SPI的曲線向右側(cè)移動(dòng)，擠壓后蛋白粒徑提高且隨著溫度的提高而增大（40～80 ℃），這可能是由于蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)之間熱誘導(dǎo)形成聚集體，然后在80 ℃團(tuán)聚。隨著溫度的繼續(xù)升高，由于蛋白質(zhì)的分解和降解，顆粒尺寸減小[25]?？梢杂^察到，在不同溫度下加入GSPE后，SPI-GSPE復(fù)合物粒徑相較于擠壓后的SPI顯著降低（<0.05）。這可能是由于SPI與GSPE相互作用的增強(qiáng)。擠壓熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變性和重排，暴露了隱藏的疏水氨基酸殘基，并解開了多肽鏈，從而大大加強(qiáng)了SPI與GSPE的相互作用，形成了更加致密的復(fù)合物[26]。

圖3 不同擠壓溫度下SPI及SPI-GSPE復(fù)合物疏水性

圖4 不同擠壓溫度下SPI及SPI-GSPEζ-電位

圖5 不同擠壓溫度下SPI及SPI-GSPE粒徑分布

2.6 持水性及持油性

圖6顯示了不同擠壓溫度（40、60、80、100和120 ℃）下SPI和SPI-GSPE的持水性。隨著擠壓溫度的升高，SPI及SPI-GSPE復(fù)合物的持水能力均降低。這可能是由于蛋白經(jīng)過擠壓處理后，其疏水基團(tuán)暴露導(dǎo)致水結(jié)合位點(diǎn)減少，持水性降低[27]。與SPI相比，隨著GSPE的加入，蛋白的持水性顯著提高（<0.05），這可能是由于GSPE的活性基團(tuán)通過氫鍵和疏水鍵等非共價(jià)鍵與SPI連接，形成可溶性的聚集體，氫鍵和范德華力的相互作用力可以使水分子進(jìn)入蛋白內(nèi)部，從而SPI的持水性得到提高[28]。

圖6 不同擠壓溫度下SPI及SPI-GSPE持水性及持油性

持油性在食品加工中的應(yīng)用也是重要的指標(biāo)。圖6顯示的是不同擠壓溫度對(duì)SPI的持油性的影響。SPI擠壓后持油性變化不大。隨著溫度的升高，擠壓SPI持油性先升高后降低，并在80 ℃時(shí)達(dá)到最大值。這可能與親脂性位點(diǎn)的增加有關(guān)。經(jīng)過擠壓處理后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致溶劑接觸環(huán)境的極性表面所不能接觸到的部位暴露。露出的疏水基團(tuán)能與更多脂肪相互作用，因此増加了蛋白質(zhì)的持油性[29]。溫度在80 ℃后，持油性的降低可能歸因于新的分子間鍵、結(jié)構(gòu)和不溶性蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。加入GSPE后，除40 ℃和80 ℃外，其余溫度下蛋白持油性均顯著下降（<0.05），這可能是由于隨著SPI與GSPE的相互作用，兩者形成不可溶復(fù)合物，蛋白與脂質(zhì)結(jié)合能力下降，蛋白持油性下降[30]。

2.7 熒光光譜

蛋白質(zhì)其色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基，被認(rèn)為具有固定的發(fā)射熒光。激發(fā)波長為280 nm時(shí)，可以忽略苯丙氨酸。圖7為不同擠壓溫度下SPI的內(nèi)源熒光光譜和最大吸收波長（max）。max與色氨酸殘基所處微環(huán)境有關(guān)，max大于330 nm表明色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中，max越大色氨酸殘基的微環(huán)境極性越強(qiáng)[31]。

注：a為擠壓溫度為80 ℃的SPI-GSPE復(fù)合物，b→f分別為擠壓溫度為80、60、100、120、40 ℃的SPI，g為未擠壓SPI。

未經(jīng)擠壓處理的SPI表現(xiàn)出最低水平的熒光強(qiáng)度。溫度處于40 ℃時(shí)，SPI熒光強(qiáng)度與未擠壓SPI無顯著性差異，隨著擠壓溫度的提高（40～80 ℃），熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)升高的趨勢，并使得SPI的max從353.2 nm紅移至354.5 nm，這表明色氨酸殘基周圍環(huán)境趨于極性，同時(shí)使SPI三級(jí)結(jié)構(gòu)變的松散。這可能是由于經(jīng)過擠壓處理后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞。隨著溫度的升高（80～120 ℃），熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)下降的趨勢，且max藍(lán)移1.4 nm至353.1 nm。這可能是由于在高溫高剪切的作用下，蛋白的空間結(jié)構(gòu)更緊密，發(fā)色基團(tuán)被掩埋。如圖7所示，在80 ℃時(shí)，隨著GSPE的加入，蛋白質(zhì)最大發(fā)射峰max發(fā)生輕微藍(lán)移，使其從354.5 nm藍(lán)移至353.4 nm，這意味著蛋白中熒光團(tuán)殘基的周圍環(huán)境在加入GSPE后變得普遍趨于非極性，即GSPE對(duì)蛋白構(gòu)象產(chǎn)生了一定的影響。Li等[32]發(fā)現(xiàn)原花青素會(huì)導(dǎo)致牛血清蛋白熒光光譜藍(lán)移，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.8 紅外光譜

利用FT-IR進(jìn)一步表征不同擠壓溫度對(duì)SPI及SPI-GSPE復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響（圖8）。酰胺I帶和酰胺II帶的光譜位移代表著蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，酰胺A（3 600～3 300 cm-1）位置的峰強(qiáng)度通?？梢员硎維PI分子內(nèi)部及其分子間-H、O-H、C-H鍵伸縮振動(dòng)的強(qiáng)度[33]。隨著溫度不斷升高（40～80 ℃），在2 932 cm-1位置的峰呈現(xiàn)震動(dòng)，這說明擠壓熱處理對(duì)SPI分子內(nèi)的C-H 鍵產(chǎn)生了一定的影響。當(dāng)擠壓溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，可以看到波數(shù)在3 000 cm-1左右發(fā)生明顯變化，該區(qū)主要為C-H伸縮振動(dòng)區(qū)，表明當(dāng)擠壓溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)開始發(fā)生變性。除此之外，酰胺A帶（3 300 cm～3 400 cm-1）伸縮振動(dòng)也可用于佐證蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合后復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）可以體現(xiàn)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。研究表明[34]，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與各吸收峰間波數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)為：-螺旋：1 646～1 664 cm-1；-折疊：1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1；-轉(zhuǎn)角：1 664～1 681 cm-1；無規(guī)卷曲：1 637～1 645 cm-1。如圖8所示，隨著GSPE的添加，SPI酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）的吸光度下降，并且其紅外吸收峰發(fā)生藍(lán)移，這表明SPI通過與GSPE的相互作用使蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

注：a為未擠壓SPI、b→f分別為擠壓溫度在120、100、80、40、60 ℃的SPI。

同時(shí)計(jì)算得出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)不同種類的含量，結(jié)果見表2。

表2 SPI及SPI-GSPE復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

注：SPI40為擠壓溫度40 ℃下的SPI；*為擠壓后SPI及SPI-GSPE復(fù)合物組間有差異性。

Note: SPI40 is SPI at extrusion temperature of 40 ℃; * is SPI after extrusion and SPI-GSPE complex has differences among groups.

數(shù)據(jù)表明，SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以-折疊為主，這與Plietz等[35]研究結(jié)果一致。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)過不同擠壓溫度處理后，各成分含量有明顯變化。在第一階段（40～80 ℃）螺旋、-轉(zhuǎn)角及均呈現(xiàn)增加的趨勢，且于80 ℃達(dá)到最大值，-折疊呈現(xiàn)遞減的趨勢，無規(guī)卷曲變化不大。表明-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為-螺旋及-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。李楊等[36]研究80 ℃以上處理SPI也得出相似結(jié)論。隨著溫度的提高（80～120 ℃），-螺旋及-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)降低的趨勢，而-折疊呈上升趨勢，這可能是由于SPI全部變性，其他二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)?折疊結(jié)構(gòu)，而-折疊結(jié)構(gòu)含量反映了蛋白疏水位點(diǎn)的暴露程度[37]。

如表2所示，與擠壓SPI相比，所有添加GSPE樣品的SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量都發(fā)生了改變，其中-螺旋、無規(guī)則卷曲及-轉(zhuǎn)角含量顯著升高（<0.05），可能是由于GSPE與SPI間的氫鍵作用引起的。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)探究了擠壓熱處理SPI與SPI-GSPE復(fù)合物對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：

1）相較于未擠壓大豆分離蛋白（Soy Isolate Protein，SPI），擠壓SPI的乳化活性指數(shù)（EmulsifyingActivity Index，EAI）、表面疏水性及粒徑均顯著提高（<0.05），其溶解度、-電位絕對(duì)值、持水性顯著下降（<0.05），SPI乳化穩(wěn)定性指數(shù)（Emulsion Stability Index，ESI）經(jīng)過擠壓處理后顯著提升，但當(dāng)溫度超過80 ℃時(shí)，SPI的ESI低于未擠壓SPI。

2）不同溫度下，葡萄籽原花青素（Grape Seed Proanthocyanidin Extract，GSPE）的加入使得擠壓熱處理SPI的-電位絕對(duì)值增大，復(fù)合物粒徑變小，EAI、ESI、持水性及溶解度增強(qiáng)，但表面疏水性、持油性有所下降。

3）隨著溫度升高（40～80 ℃），SPI-GSPE復(fù)合物的溶解度、EAI、粒徑顯著增大（<0.05），其ESI、表面疏水性、及-電位絕對(duì)值顯著減?。?0.05），當(dāng)溫度進(jìn)一步升高（80～120 ℃），SPI-GSPE復(fù)合物表面疏水性顯著增大（<0.05），其EAI、ESI、溶解度、-電位絕對(duì)值、粒徑、及持油性均顯著降低（<0.05）。

4）熒光光譜結(jié)果表明與GSPE的復(fù)合使得蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)中的發(fā)色基團(tuán)所處的微環(huán)境極性提高，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

5）紅外光譜結(jié)果顯示隨著GSPE的加入，蛋白-螺旋、-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲含量均提高，SPI與GSPE在擠壓過程中通過疏水相互作用結(jié)合。隨著擠壓溫度的升高，螺旋、-轉(zhuǎn)角至80 ℃達(dá)到最大值。-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為-螺旋及-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明擠壓溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)較好。本研究結(jié)果闡明了不同擠壓溫度對(duì)SPI-GSPE復(fù)合物功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)影響，為進(jìn)一步改善SPI的功能性質(zhì)，使其更好地應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Effects of extrusion temperature on the functional and structural properties of soybean protein isolate and proanthocyanidin complex

Wang Zhenguo, Gao Yuzhe, Shi Jiafeng, Zhang Junjie, Jiang Ruisheng, Huo Jinjie, Su Shuang, Xiao Zhigang※

(,110034,)

The interaction between macromolecules and small molecules has gradually attracted widespread interest in recent years, especially for the interaction between proteins and polyphenols in food components. Phenolic compounds are the parts of the secondary metabolites, mainly found in plant species with great structural diversity. They can exist as glycosides or aglycones, mainly composed of polymeric or monomer structures. Protein is widely found in animals and plants. In the course of food processing, the protein and polyphenols can inevitably coexist in the same system and then interact with each other, which often changes the structure of protein levels. There are some effects of the interaction between polyphenols and proteins on the functional properties of proteins, mainly including the hydration properties (water retention, viscosity, and solubility) and surface properties (foaming and emulsification). The beneficial interactions can improve the nutritional and functional properties of foods. However, the interaction between proteins and polyphenols is susceptible to a variety of factors, including internal factors (self factors, such as the structural characteristics and relative concentrations of proteins and polyphenols), and external factors (environmental factors, mainly including the solvent composition and solution parameters, such as temperature, ionic strength, and pH). The extrusion technique is a physical modification to integrate multiple unit operations, such as material mixing, homogenization, cooking, and molding. In this study, an attempt was made to clarify the effect of proanthocyanidins on the physicochemical properties of soy protein as a representative plant protein, considering the important role of proteins and phenols in health, nutrition, and food quality. Specifically, an investigation was implemented on the effects of different extrusion temperatures (40, 60, 80, 100, and 120℃) on the functional and structural properties of Soybean Protein Isolation (SPI) and Grape Seed Procyanidins Extractive (GSPE) complex. The indicators were selected as emulsifying activity index, emulsion stability index, zeta potential, and particle size. Fluorescence and infrared spectroscopy were used to analyze the functional properties and structure of SPI in the composite system. The results show that there were significantly improved solubility, emulsifying activity, emulsifying stability, absolute value of Zeta potential, and water holding capacity of SPI-GSPE composite after extrusion treatment, compared with the extruded SPI. But, there was an observable decrease in the surface hydrophobicity and oil-holding capacity of the SPI-GSPE composite. Specifically, the solubility, oil retention, and emulsification activity of SPI-GSPE composite first increased, then decreased, and finally reached the maximum at 80℃, with the increase of extrusion temperature. By contrast, the surface hydrophobicity of the SPI-GSPE composite first decreased, then increased, and finally reached the minimum at 80℃. The absolute value of Zeta potential, emulsification stability, and water retention all decreased with the increase in temperature. The particle-size analysis showed that the SPI and GSPE formed a more compact complex after extrusion. The fluorescence spectrum showed that the composite and extrusion with the GSPE were used to extend the skeleton of SPI polypeptide chain for the protein structure, indicating a significant quenching effect on the SPI fluorescence. Ir spectra showed that the non-covalent cross-linking of GSPE to SPI varied greatly in the secondary structure of proteins. The composition and extrusion with the GSPE increased the-helix, irregular crimp, and-corner contents of the SPI, but decreased the-fold contents. This finding can provide important theoretical guidance for the utilization of SPI and GSPE resources.

extrusion; structural properties; functional properties;procyanidins; soy isolate protein

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.032

TS213.3

A

1002-6819(2022)-21-0279-08

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Wang Zhenguo, Li Hang, Zhang Junjie, et al. Effects of extrusion temperature on the functional and structural properties of soybean protein isolate and proanthocyanidin complex[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(21): 279-286. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.032 http://www.tcsae.org

2022-03-29

2022-07-30

遼寧省“揭榜掛帥”科技攻關(guān)專項(xiàng)計(jì)劃（2021JH/104000340201）、國家自然科學(xué)基金（32072139）

王振國，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白工程。Email：wangzhenguo12216@163.com

肖志剛，博士，教授，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白工程。Email：zhigang_xiao@126.com