李贊 嚴(yán)定逸 姜冉 陸康 曹亞利 陳蘭華 羅敏 黃春霞

【摘要】 目的 研究不同濃度的芍藥苷對(duì)全氟辛烷磺酸基化合物（PFOS）損傷小鼠肝臟的抑制作用。方法 通過(guò)給小鼠灌服全氟辛烷酸鉀（10 mg/kg，連續(xù) 灌胃18 d）建立小鼠肝臟氧化損傷模型。建模后，40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)表的方法分為模型對(duì)照組，高、中、低劑量組[芍藥苷100、50、10 mg/（kg·d）]及陽(yáng)性對(duì)照組[益肝靈片100 mg/（kg·d）]，連續(xù)灌胃給藥3周。分別檢測(cè)小鼠血清和肝臟各種酶的水平，包括ALT、AST和血清堿性磷酸酶（ALP）以及肝臟丙二醛和超氧化物歧化酶（SOD），另外采用HE染色法檢測(cè)肝臟中組織學(xué)是否發(fā)生改變。結(jié)果 芍藥苷不僅使肝臟中的SOD水平升高，而且使丙二醛水平降低（P均< 0.05），進(jìn)而有效緩解了PFOS導(dǎo)致的肝臟氧化損傷;芍藥苷能有效降低小鼠血清ALT、AST及ALP的水平（P均< 0.05），有效緩解PFOS導(dǎo)致的肝臟氧化損傷;在病理學(xué)上，芍藥苷能有效改善PFOS導(dǎo)致的肝組織淤血、肝臟局部組織紊亂、細(xì)胞及組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、局部組織壞死;PFOS對(duì)于小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)起到了抑制作用;在給予芍藥苷治療后，小鼠的體質(zhì)量抑制得到緩解（P均< 0.05）。結(jié)論 PFOS可以引起肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在一定程度上對(duì)肝臟組織造成氧化性損傷，芍藥苷對(duì)于PFOS導(dǎo)致的肝臟氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 芍藥苷;全氟辛烷磺酸基化合物;肝損傷;抗氧化損傷

Protective effect of paeoniflorin on PFOS-induced oxidative liver damage in mouse models Li Zan△， Yan Dingyi， Jiang Ran，Lu Kang， Cao yali， Chen Lanhua， Luo Min， Huang Chunxia. △Changsha Medical University，Changsha 410219， China

Corresponding author， Huang Chunxia， E-mail： 1923778@qq.com

【Abstract】 Objective To investigate the effect of perfluorooctane sulfonate （PFOS） in mice. Methods The mouse models of oxidative liver injury were established by gavage of potassium perfluorooctane at a dose of 10 mg/kg for consecutive 18 d. After model establishment， 40 mice were divided into the model control group， high-dose， medium-dose and low-dose paeoniflorin groups （100 mg/（kg·d）， 50mg/（kg·d）， 10mg/（kg·d）） and positive control group （100 mg/（kg·d）， Yiganling tablet） by random number table method， and were given with intragastric administration for consecutive 3 weeks. The serum levels of alkaline phosphatase （ALP）， aspartate aminotransferase （AST） and alanine aminotransferase （ALT）， and the levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in the liver tissues of mice were determined. The histological changes of liver were observed by hematoxylin-eosin staining. Results Paeoniflorin significantly increased the SOD level， whereas decreased the MDA level in the liver tissues （both P < 0.05）， thereby effectively alleviating the oxidative liver damage caused by PFOS. Paeoniflorin could significantly reduce the serum levels of ALT， AST and ALP （all P < 0.05）， and effectively mitigated the oxidative liver damage caused by PFOS. Pathologically， paeoniflorin could effectively alleviate liver tissue congestion， local liver tissue disorder， cell and tissue edema， inflammatory cell infiltration， and local tissue necrosis induced by PFOS. PFOS could also inhibit the weight gain of mice. After paeoniflorin treatment， the inhibitory effect upon mouse weight was significantly alleviated （all P < 0.05）.Conclusions PFOS can provoke oxidative stress responses to the liver， and lead to oxidative liver injury to certain extent. Paeoniflorin exerts certain protective effect on the development of oxidative liver injury caused by PFOS.

【Key words】 Paeoniflorin; Perfluorooctane sulfonate compound; Liver injury; Anti-oxidative damage

目前，環(huán)境污染問(wèn)題越來(lái)越受到重視，其中全氟磺酸類化合物，主要是全氟辛烷磺酸基化合物（PFOS），會(huì)對(duì)肝臟造成強(qiáng)烈的氧化損傷;因?yàn)槿镣榛撬犷愇镔|(zhì)的使用范圍非常大，所以在人和動(dòng)物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了一定濃度的PFOS，嚴(yán)重危害人類和其他生物的健康[1]。然而，芍藥苷作為藥物的主要活性物質(zhì)之一，具有抗氧化損傷和無(wú)副作用的特點(diǎn)，通過(guò)探索其對(duì)PFOS致肝氧化損傷小鼠模型的保護(hù)作用，不僅為其他類型的藥物所導(dǎo)致的肝臟損傷治療提供了借鑒方法，而且為新藥物的研制開(kāi)辟了道路。

材料與方法

一、材 料

1.藥物與試劑

生理鹽水、蒸餾水、HE染液、全氟辛烷酸鉀（純度98% 100 g）、芍藥苷（純度98%，HPLC 500 mg）由上海吉至生物科技有限公司生產(chǎn)。益肝靈片（有效成分水飛薊，規(guī)格：38.5 mg/片）由陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)。檢測(cè)血清ALT、AST、ALP水平和肝臟丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）水平的試劑盒由湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康雄性昆明小鼠（25～30 g）40只，小鼠由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制定的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)給小鼠自由喂食、飲水，每日定時(shí)稱重。規(guī)律性飼養(yǎng)1周，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)方法與流程

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的建模、分組

給小鼠灌服全氟辛烷酸鉀（10 mg/kg，連續(xù)灌胃18 d）建立小鼠肝臟氧化損傷模型。40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)表的方式分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量芍藥苷組（低劑量組）、中劑量芍藥苷組（中劑量組）及高劑量芍藥苷組（高劑量組），分別給予生理鹽水、益肝靈片溶液、10 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）的芍藥苷溶液連續(xù)灌胃3周，每次給藥0.1～0.2 mL，分別記錄各組小鼠的體質(zhì)量變化，同時(shí)注意各組小鼠的精神行為學(xué)有無(wú)差異[2]。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理規(guī)范。

2.方 法

最后1次給藥后隔24 h，小鼠稱重，從小鼠眼球中抽取2 mL血液，以3000 r/min的速度進(jìn)行離心處理，10 min后提取上清液，檢測(cè)血清ALT、AST及ALP的水平，按試劑說(shuō)明書和生化分析儀的使用方法進(jìn)行測(cè)定。后立即頸椎脫臼處死小鼠，取出肝臟用于制備組織勻漿模型，測(cè)定丙二醛、SOD以及肝臟HE染色。操作方法為用電子秤稱取肝臟組織50 mg裝入無(wú)菌試管中，加入預(yù)冷的生理鹽水，采用冰浴的方法進(jìn)行勻漿處理，使肝臟中的勻漿液水平達(dá)到10%，然后以3000 r/min的速度進(jìn)行離心處理，10 min后提取上清液，按試劑盒要求檢測(cè)小鼠肝組織勻漿丙二醛及SOD的活性，其他剩余肝臟組織用甲醛固定后用于病理學(xué)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布資料采用 表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較（各劑量組與對(duì)照組）采用LSD-t檢驗(yàn)，α=0.05。

結(jié) 果

一、芍藥苷對(duì)PFOS導(dǎo)致的肝臟氧化損傷起保護(hù)作用

陽(yáng)性對(duì)照組和低劑量組丙二醛水平與模型對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）;相反，高劑量組和中劑量組與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組、低、中劑量組SOD水平與模型對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），高劑量組SOD水平與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見(jiàn)表1。

與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、中、高劑量組均能降低小鼠血清ALT、AST及ALP的水平（P均< 0.05），與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低、中劑量組不能降低血清ALT、AST、ALP水平，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），高劑量組可以降低血清ALT、AST水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05），見(jiàn)表2。

二、芍藥苷改善了PFOS導(dǎo)致的肝臟病理學(xué)變化

由于PFOS的存在，導(dǎo)致小鼠的肝臟病理學(xué)發(fā)生了顯著改變，在病理學(xué)上表現(xiàn)為肝組織淤血、肝臟局部組織紊亂、細(xì)胞及組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、局部組織壞死，見(jiàn)圖1A。在經(jīng)給予藥物益肝靈片以及芍藥苷后，肝臟組織損傷得到緩解，肝臟病理學(xué)改變明顯減輕。隨著芍藥苷濃度的增加，肝臟修復(fù)情況呈現(xiàn)階梯型變化，圖1C、D、E與圖1B對(duì)比發(fā)現(xiàn)，芍藥苷同益肝靈片均能對(duì)肝臟損傷起到一定的治療作用。

三、芍藥苷能有效緩解PFOS對(duì)小鼠體質(zhì)量抑制作用

模型對(duì)照組體質(zhì)量為（35.54±1.82）kg，陽(yáng)性對(duì)照組為（37.96±1.38）kg，低、中、高劑量組分別為（36.19±2.61）（37.55±1.16）（37.86± 1.75）kg，模型對(duì)照組相比其他4組體質(zhì)量低，以模型對(duì)照組為基準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)除低劑量組外其他3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05），表明PFOS可能對(duì)小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)具有一定的抑制作用，而芍藥苷可能在一定程度上能緩解PFOS對(duì)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的抑制作用。

討 論

PFOS廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，PFOS在廣泛運(yùn)用之時(shí)造成了一系列污染問(wèn)題[3]。PFOS在生態(tài)系統(tǒng)中存活性極強(qiáng)，很難被降解，這是因?yàn)槠涠栊院突瘜W(xué)穩(wěn)定性較強(qiáng)，同時(shí)又難以揮發(fā)[4-5]。如今，已在世界各地的水、土壤、大氣、人類和動(dòng)物的肝臟與血清中檢測(cè)到它，使其成為威脅環(huán)境和人類健康的重要污染物之一[6-8]。 由于通過(guò)食物鏈可以進(jìn)行研究生物放大和累積影響作用，使位于食物鏈高層的高級(jí)生物體內(nèi)有高濃度的PFOS富積[9]。有大量動(dòng)物毒理學(xué)研究表明，PFOS類有機(jī)污染物會(huì)對(duì)動(dòng)物健康產(chǎn)生極大危害，其危害表現(xiàn)在諸多方面：首先基因表達(dá)不穩(wěn)定，其次會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生癌變，還會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)、發(fā)育、繁殖、免疫、肝的毒性，最后還會(huì)引起甲狀腺和內(nèi)分泌異常[10-13]。其中對(duì)肝臟的損害最為嚴(yán)重，其可增加肝細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度、肝臟脂褐質(zhì)含量、導(dǎo)致體內(nèi)有關(guān)抗氧化酶的活性下降、破壞體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)并造成肝臟氧化損傷[16]。

芍藥苷的藥理作用包括抗過(guò)敏、抗驚厥、抗炎、抗凝血和抗氧化。通過(guò)大量研究可以看出，芍藥苷能夠治療諸多與肝臟相關(guān)的疾病，比如肝臟纖維化、化學(xué)性及膽汁性肝臟損傷、脂肪肝甚至肝癌等。芍藥苷具有極強(qiáng)的抗氧化特性，能夠降低機(jī)體內(nèi)活性氧含量，降低血清及肝組織的ALT、AST 水平，有效增強(qiáng)位于肝組織的SOD、GSH、GSH-PX的酶生物活性，降低丙二醛、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-12等炎癥因子的水平[19]。研究顯示核因子-κB（NF-κB）調(diào)控PNPLA3表達(dá)參與肝臟脂肪變性的進(jìn)展，而芍藥苷可同時(shí)抑制IRAK和NF-κB相關(guān)信號(hào)通路的激活，加快凋亡因子Caspase3的表達(dá);通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)Nrf2的表達(dá)，最終從抗氧化、抗炎、抗凋亡多個(gè)機(jī)制過(guò)程保護(hù)肝臟[20-22]。此外芍藥苷不僅能夠通過(guò)刺激小鼠釋放血漿纖連蛋白來(lái)提高血藥水平進(jìn)而起到保護(hù)肝臟的效果，還能夠提升網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能來(lái)保護(hù)肝臟[23]。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明PFOS對(duì)肝臟的毒性尤為突出，PFOS 暴露后肝臟中3種抗氧化酶和丙二醛的活力下降、同時(shí)造成肝臟中SOD的水平增高;致使氧自由基不能被及時(shí)清除，而過(guò)多的氧自由基可不斷攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸而發(fā)生氧化作用，使細(xì)胞膜完整性遭到破壞，也對(duì)小鼠機(jī)體的生物大分子以及在細(xì)胞水平上造成氧化損傷。在病理上表現(xiàn)為肝臟組織淤血、肝臟局部組織壞死紊亂、肝細(xì)胞及組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)PFOS 的腸道吸收率較高，攝入后優(yōu)先黏附在肝臟中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的蛋白質(zhì)上。此時(shí)因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激調(diào)控以及過(guò)多的自由基能使線粒體內(nèi)一些重要的酶類如脫氫酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶失去活性，肝細(xì)胞溶酶體膜滲漏加上細(xì)胞蛋白水解阻礙了能量和物質(zhì)的代謝，更容易引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的脂滴堆積增加，造成肝臟的脂質(zhì)代謝紊亂。此外，PFOS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過(guò)抑制 Akt/mTOR信號(hào)通路，上調(diào)肝臟凋亡相關(guān)蛋白抑制 Nrf2通路相關(guān)的蛋白表達(dá)水平，引起細(xì)胞自噬和凋亡，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。

PFOS可增加肝細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度，降低體內(nèi)抗氧化酶活性，破壞抗氧化防御系統(tǒng)，并增加肝臟脂褐質(zhì)含量;介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)降低機(jī)體抗氧化防御能力，誘發(fā)肝細(xì)胞 DNA 損傷。而芍藥苷通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)Nrf2的激活，發(fā)揮抗氧化和抗炎能力的功能，Nrf2通過(guò)上調(diào)可抑制氧化應(yīng)激及肝星狀細(xì)胞的生成;同時(shí)激活還原型輔酶Ⅱ使一氧化氮、氧自由基的生成減少;提高肝組織SOD、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力，從根源上對(duì)PFOS的毒性機(jī)理進(jìn)行抑制，完成對(duì)PFOS造成的化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，在給予藥物以及芍藥苷治療之后，小鼠血清ALT、AST、ALP水平以及肝臟組織丙二醛水平隨之降低;SOD水平增高;且肝臟的病理學(xué)改變?cè)谝欢ǔ潭壬系玫交謴?fù)，并存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系;其中高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，高劑量組的效果更佳。由此可知，藥物芍藥苷與藥物益肝靈片同樣可起到保護(hù)肝臟的作用，在一定程度上芍藥苷的效果更佳。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-06-25）

（本文編輯：楊江瑜）