曹瑩琪 江曉晗 曾 歡 劉曉婷 周向梅 袁建敏

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)(2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

軟飲料的消費(fèi)已成為一個(gè)高度可見(jiàn)和有爭(zhēng)議的公共衛(wèi)生和公共政策問(wèn)題。數(shù)據(jù)顯示我國(guó)成人居民來(lái)自含糖飲料的添加糖攝入量平均每人每日為13.4 g，且總體消費(fèi)率呈上升趨勢(shì)[1]。軟飲料被許多人認(rèn)為是肥胖癥和相關(guān)健康問(wèn)題的主要貢獻(xiàn)者，而關(guān)于軟飲料對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、組織臟器等方面的研究較少。本研究選擇市場(chǎng)上常見(jiàn)的四種軟飲料——美年達(dá)、可樂(lè)、綠茶飲料、咖啡飲料，給小鼠飲用2個(gè)月，觀察小鼠增重、血清生化指標(biāo)、器官系數(shù)以及組織細(xì)胞損傷等，進(jìn)行綜合比較和分析，以期為人們科學(xué)合理地飲用軟飲料提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用斷乳SPF 級(jí)KM小鼠80只，雌雄各40只，雄鼠體質(zhì)量12.2～15.0 g，雌鼠體質(zhì)量7.8～9.5 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(京)2016-0006】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(京)2020-0037】，所有實(shí)驗(yàn)均獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)與監(jiān)督【IACUC號(hào)：AW02010202-2】。實(shí)驗(yàn)者嚴(yán)格遵循國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理“3R”原則，給予小鼠應(yīng)有的人道關(guān)懷。小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，環(huán)境溫度(24.72±1.90)℃，環(huán)境相對(duì)濕度64.40%±17.59%。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的SPF級(jí)小鼠飼料以及墊料；實(shí)驗(yàn)飲料為美年達(dá)、百事可樂(lè)、統(tǒng)一綠茶和三得利利趣拿鐵，均為合格市售品牌，且均在保質(zhì)期內(nèi)；對(duì)照組飲用煮沸后自然冷卻的北京市自來(lái)水。

1.3 儀器設(shè)備

全自動(dòng)生化儀(型號(hào)：日立7600，日立集團(tuán))，放免儀(型號(hào)：xh6080，西安核儀廠)，電子天平(型號(hào)：JM1102-JM1003，上海紀(jì)銘)，冷凍型高速臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)：SORVALL Stratos，Thermo)。生化指標(biāo)由北京萊雅生物科技有限公司分析檢測(cè)完成。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將80只小鼠隨機(jī)分為5個(gè)處理組，分別是美年達(dá)組、可樂(lè)組、綠茶組、咖啡組和白開(kāi)水組，每組8只雌鼠和8只雄鼠，雌雄分籠飼養(yǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 每組小鼠均飼以相同飼料，自由進(jìn)食, 并飲用相應(yīng)的飲料。實(shí)驗(yàn)期間，每10 d測(cè)1次體質(zhì)量和采食量。

2.2 樣本采集和處理

實(shí)驗(yàn)第66天，每個(gè)處理組分別取5只雄鼠和5只雌鼠。采用摘眼球采血法取得血液樣品，分離血清樣本，檢測(cè)生化指標(biāo)。安樂(lè)死小鼠后分離雙側(cè)股骨、心臟、肝、脾、肺、腎，并用電子稱(chēng)精確稱(chēng)重，計(jì)算臟器系數(shù)。每組隨機(jī)取3只雄鼠和3只雌鼠的肝、腎組織，制作病理切片。

2.3 血液生化指標(biāo)的測(cè)定

由北京萊雅生物科技有限公司檢測(cè)鈣、血糖(blood glucose,GLU)、三酰甘油(triglyceride,TG)、尿素氮(UREA/blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,CRE)、白蛋白(albumin,ALB)、總蛋白(total protein,TP)水平，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)活力。

2.4 小鼠肝和腎病理切片

將肝與腎組織固定于4%多聚甲醛中，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色并觀察。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 不同類(lèi)型飲料對(duì)小鼠增重及日均采食量的影響

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)第10天，與白開(kāi)水組相比雄鼠飲用美年達(dá)、可樂(lè)、綠茶和咖啡后的體質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)第20天，雄鼠飲用美年達(dá)、可樂(lè)、綠茶后的體質(zhì)量均顯著高于咖啡組和白開(kāi)水組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第30～66天時(shí)，同時(shí)期的各飲料組的雄鼠體質(zhì)量較對(duì)照組減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。由圖2可知，各時(shí)段不同飲料處理組的雄鼠日采食量少于白開(kāi)水組。

圖1 不同組別雄鼠的體質(zhì)量變化

圖2 不同組別雄鼠的日均采食量

由圖3可知，實(shí)驗(yàn)第10天，雌鼠飲用美年達(dá)、綠茶、咖啡后的體質(zhì)量均顯著高于白開(kāi)水組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)第20、30天，與白開(kāi)水組相比，雌鼠飲用4種軟飲料后的體質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第40、50、60天，同時(shí)期的處理組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)第66天，雌鼠飲用美年達(dá)、咖啡后，體質(zhì)量顯著高于白開(kāi)水組(P<0.05)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，飲用各種飲料的雌鼠體質(zhì)量均有所升高。由圖4可知，咖啡組的雌鼠采食量在實(shí)驗(yàn)后期高于其他組，美年達(dá)組在各期均低于其他組。

圖3 不同組別雌鼠的體質(zhì)量變化

圖4 不同組別雌鼠的日均采食量

3.2 不同類(lèi)型飲料對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

由表1，2可知，除脾系數(shù)(P<0.05)和肺系數(shù)(P<0.05)外，不同類(lèi)型飲料對(duì)雌雄小鼠的心臟系數(shù)、肝系數(shù)、肺系數(shù)、腎系數(shù)和肱骨系數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表1 不同組別雄鼠的內(nèi)臟器官指數(shù)(%)

表2 不同組別雌鼠的內(nèi)臟器官指數(shù)(%)

3.3 不同類(lèi)型飲料對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

由表3可知，雄鼠飲用美年達(dá)、可樂(lè)后的尿素氮水平顯著低于其余處理組(P<0.05)；飲用綠茶的雄鼠三酰甘油含量顯著高于白開(kāi)水對(duì)照組(P<0.05)；雄鼠飲用該4種不同的飲料后，其總蛋白含量均高于白開(kāi)水對(duì)照組，但除綠茶組外其余處理組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。血糖、肌酐、白蛋白等指標(biāo)在各處理組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 不同組別雄鼠的生化指標(biāo)

由表4可知，不同類(lèi)型飲料對(duì)雌鼠的生化指標(biāo)影響比對(duì)雄鼠的影響更為明顯。雌鼠飲用該4種軟飲料后，其尿素氮水平均顯著低于白開(kāi)水對(duì)照組(P<0.05)。雌鼠飲用美年達(dá)和綠茶后的肌酐水平顯著低于白開(kāi)水對(duì)照組(P<0.05)。4個(gè)處理組的堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量均低于白開(kāi)水組，其三酰甘油含量均高于白開(kāi)水組。

表4 不同組別雌鼠的生化指標(biāo)

3.4 不同類(lèi)型飲料對(duì)小鼠肝、腎組織結(jié)構(gòu)的影響

美年達(dá)和可樂(lè)組的肝損傷程度最高，綠茶和咖啡組損傷程度較輕。由圖5中可看出，白開(kāi)水組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，肝竇清晰，肝細(xì)胞形態(tài)大小正常，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核明顯，且無(wú)變性壞死，肝細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)脂滴。而美年達(dá)和綠茶組的肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，界限不清，胞質(zhì)里有紅染顆粒，即出現(xiàn)了一定程度的顆粒變性?？蓸?lè)組肝細(xì)胞中可見(jiàn)細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，胞質(zhì)淡染或呈大小不一的空泡，且出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?？Х冉M肝細(xì)胞界限不清，胞質(zhì)內(nèi)有紅染顆粒，顆粒變性較為嚴(yán)重。

注：A.細(xì)胞腫大，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡；B.炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C.細(xì)胞腫大，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡；D.細(xì)胞內(nèi)的紅染顆粒，細(xì)胞界限不清；E.肝正常。F、G、H出現(xiàn)蛋白管型，I、J為正常腎。

白開(kāi)水組小鼠的腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管形態(tài)正常，各結(jié)構(gòu)間界限清晰。美年達(dá)、可樂(lè)、綠茶組腎小管內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，咖啡組腎組織正常。

以上結(jié)果說(shuō)明軟飲料可引起機(jī)體的物質(zhì)代謝障礙，對(duì)組織細(xì)胞造成損傷。

4 討論

在實(shí)驗(yàn)前期，飲用美年達(dá)、綠茶和可樂(lè)的雄鼠體質(zhì)量均顯著高于白開(kāi)水組，實(shí)驗(yàn)后期則明顯降低。而飲用咖啡的雄鼠體質(zhì)量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大多高于白開(kāi)水組。相比于雄鼠，軟飲料對(duì)雌鼠的增重影響更為明顯，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，飲用4種飲料的雌鼠體質(zhì)量均高于白開(kāi)水組。這是因?yàn)檫@4種飲料中均含有較高的糖分，增加了攝入的能量，雖然實(shí)驗(yàn)早期小鼠通過(guò)減少食物攝入來(lái)維持?jǐn)z入總能量的平衡[2]，但總體上能量攝入仍過(guò)多，故體質(zhì)量均明顯增加[3-4]。但長(zhǎng)期飲用含糖飲料會(huì)抑制小鼠食欲，導(dǎo)致其進(jìn)食減少，營(yíng)養(yǎng)不均衡[5]，因此雄鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)后期下降，但由于對(duì)雌鼠的食欲抑制較不明顯，故雌鼠體質(zhì)量并沒(méi)有下降。相比于其他飲料，咖啡對(duì)雌雄鼠的食欲抑制較小，原因可能是咖啡因可興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的迷走中樞，刺激迷走神經(jīng)胃支，從而引起胃泌酸增加和胃腺分泌亢進(jìn)[6]。

臟器系數(shù)的變化通?？梢暂^好地反映受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器的影響或者初步的毒性判斷。本次研究中，各處理組心臟、肝、腎、肱骨的臟器系數(shù)和白開(kāi)水組無(wú)顯著差異，與參考文獻(xiàn)[7]的研究相符。由此看出，該4種飲料對(duì)小鼠的心臟、肝、腎和肱骨的發(fā)育無(wú)急性毒性損傷作用。

在血清生化指標(biāo)方面，本實(shí)驗(yàn)中小鼠飲用軟飲料后總蛋白含量顯著升高。血清總蛋白主要反映肝在蛋白質(zhì)代謝方面的功能、慢性肝損傷及其病情程度以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的儲(chǔ)備功能[8]。本實(shí)驗(yàn)中總蛋白升高的原因可能是軟飲料中含有較多的糖類(lèi)、色素等物質(zhì)，使機(jī)體血液滲透壓升高，進(jìn)而導(dǎo)致脫水所致。尿素氮是動(dòng)物蛋白質(zhì)在肝代謝后的最終產(chǎn)物，血清尿素氮和肌酐含量可反映動(dòng)物肝、腎的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠飲用軟飲料后的尿素氮、肌酐含量均降低，無(wú)臨床診斷意義，說(shuō)明軟飲料對(duì)小鼠的損傷并不顯著。大量果糖攝入可快速刺激脂肪生成和三酰甘油的積累[9]，本實(shí)驗(yàn)中雌鼠飲用4種飲料后，血清三酰甘油均增加，這可能會(huì)增加患冠心病的危險(xiǎn)性，而且三酰甘油過(guò)高還會(huì)引起脂肪肝、糖尿病、慢性腎炎等疾病[8]。在血糖指標(biāo)上，本實(shí)驗(yàn)與參考文獻(xiàn)[7]的研究相符，飲用軟飲料并未造成血糖含量的顯著變化。

軟飲料中含有高果糖玉米糖漿，果糖轉(zhuǎn)化成的脂肪在肝中積累可導(dǎo)致非酒精性脂肪肝疾病。此外可樂(lè)中含有的焦糖色素富含高級(jí)糖基化終產(chǎn)物，也可能增加胰島素抵抗和產(chǎn)生炎性反應(yīng)。胰島素抵抗和氧化應(yīng)激增加了游離脂肪酸向肝的輸送，肝三酰甘油酯積累的增加也導(dǎo)致了脂肪肝[10]。果糖過(guò)多導(dǎo)致大鼠肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化和脂肪變性，脂質(zhì)過(guò)氧化可能在果糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中起作用[11]。這與本實(shí)驗(yàn)碳酸飲料組導(dǎo)致肝組織變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)果一致。有研究[12-13]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲用碳酸飲料會(huì)對(duì)腎的組織產(chǎn)生不利影響，出現(xiàn)明顯的蛋白尿，腎小管中出現(xiàn)透明管型等，且飲用富含果糖的飲料后可觀察到更大的腎氧化應(yīng)激和輕度腎損傷(腎小球和腎小管改變)[14]，這與本研究中腎出現(xiàn)蛋白管型的結(jié)果一致。而未見(jiàn)咖啡和綠茶對(duì)肝損傷的相關(guān)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了輕度損傷的可能原因是咖啡和茶飲料當(dāng)中含有較多的糖分。

值得關(guān)注的是，長(zhǎng)期飲用上述4種軟飲料對(duì)雌鼠的影響比對(duì)雄鼠的影響更為明顯，推測(cè)其可能與性激素影響某些代謝酶的活性有關(guān)，有研究表明，雄性激素能夠促進(jìn)細(xì)胞色素P-450的活性，而雌性激素可以抑制肝微粒體的氧化過(guò)程，所以一些化學(xué)物對(duì)雌性動(dòng)物的不良影響顯著大于對(duì)雄性動(dòng)物的不良影響[15]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明長(zhǎng)期飲用軟飲料對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育存在不良影響，促進(jìn)小鼠早期增重過(guò)快并促進(jìn)脂肪的合成，同時(shí)也會(huì)使肝、腎組織出現(xiàn)一定程度的病理變化。