敖金成，李博，閻凱，李永梅*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

受耕地資源短缺及種植其他非煙經(jīng)濟(jì)作物的影響，云南烤煙連作現(xiàn)象極為嚴(yán)重。連作引起連作障礙[1-4]。近年來(lái)，關(guān)于烤煙連作障礙導(dǎo)致的煙葉品質(zhì)和耕地質(zhì)量下降問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注。在眾多連作障礙成因中，有研究認(rèn)為根際微生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)可能是發(fā)生連作障礙的主要原因[5]?？緹熯B作破壞了微生物種群的平衡，抑制土壤酶活性[6]，降低了土壤微生物的種群多樣性和功能多樣性[7]，致使煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單[8]。土壤細(xì)菌是土壤養(yǎng)分循環(huán)重要的驅(qū)動(dòng)者[9]，具有重要的生態(tài)功能[10-12]。烤煙黃壤連作5 年后，其土壤細(xì)菌群落多樣性和豐度開始下降，并在連作12 年時(shí)降至最低[13]，連作條件下土壤細(xì)菌多樣性明顯低于輪作[14]。王佩雯等[15]的研究認(rèn)為，連作植煙土壤細(xì)菌群落易受環(huán)境變化的影響，表現(xiàn)出一定的時(shí)間差異性。在實(shí)際生產(chǎn)中，不同區(qū)域相同連作年限地塊作物的發(fā)病率、田間長(zhǎng)勢(shì)等也存在差異，但這種差異是否與土壤細(xì)菌群落演化有關(guān)鮮見報(bào)道。因此，了解連作煙田土壤細(xì)菌群落的區(qū)域特征，對(duì)進(jìn)一步理解土壤微環(huán)境對(duì)連作的響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

以往傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法，如微生物平板培養(yǎng)法、生物標(biāo)記法、Biolog鑒定系統(tǒng)法等[16]很難客觀全面地反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成。高通量測(cè)序技術(shù)有效避免了傳統(tǒng)方法通量低、操作復(fù)雜和準(zhǔn)確率低等缺陷[17]，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模土壤微生物基因直接測(cè)序[18]，在土壤微生物物種多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性、功能多樣性、遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用[15，19-20]?；诖耍狙芯恳栽颇鲜∏甘?、紅河州、文山州3 個(gè)典型煙區(qū)不同連作年限土壤為研究對(duì)象，旨在了解不同生態(tài)區(qū)連作煙田土壤細(xì)菌群落特征，加深對(duì)連作條件下土壤微生物演替規(guī)律的認(rèn)識(shí)，為制定連作障礙消減措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 連作土壤采集區(qū)概況

試驗(yàn)于2020 年3—4 月烤煙移栽前，在云南省曲靖市（103°23′10″E，25°20′20″N）、紅河州（103°52′26″E，24°40′03″N）、文山州（104°31′23″E，23°48′56″N）3 個(gè)典型煙區(qū)分別選取2、4 a 和8 a 及以上連作地塊，按梅花形五點(diǎn)法取耕作層（0～20 cm）土壤，對(duì)照（連作0 a）為同區(qū)域撂荒2 a 及以上土壤。取樣時(shí)輕輕撥開表土，去除根系等雜物，將混合土樣分為2 份，一份用于土壤化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)，常溫風(fēng)干后備用，另一份裝入無(wú)菌密封袋，并及時(shí)置于-20 ℃冰盒，快速帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱待用。每個(gè)生態(tài)區(qū)每種連作年限煙田隨機(jī)取5個(gè)混合樣，共計(jì)60個(gè)土樣。曲靖采樣點(diǎn)土壤類型為黃壤，紅河和文山采樣點(diǎn)土壤類型為紅壤。土壤基礎(chǔ)化學(xué)性質(zhì)見表1。試驗(yàn)煙田均為不同農(nóng)戶自己栽種，植煙歷史可考證。3 個(gè)生態(tài)區(qū)主栽烤煙品種均為云煙87。

云南曲靖煙區(qū)地處滇東高原烤煙區(qū)，地勢(shì)較為平坦，烤煙栽培歷史悠久，是我國(guó)重要的煙葉產(chǎn)區(qū)，烤煙產(chǎn)量約占云南的1/3、全國(guó)的1/10。栽煙地海拔1 500～2 100 m，年均氣溫為13.3～15.1 ℃，烤煙大田生育期降水量為740.0～810.0 mm。云南紅河、文山煙區(qū)同屬滇南低山丘陵烤煙區(qū)，地勢(shì)平緩，多數(shù)栽煙地海拔在1 100～1 600 m 之間，熱量條件優(yōu)越，降水充沛，年均溫為16.0～18.0 ℃，烤煙大田生育期降水量為1 000.0 mm 左右。紅河州為云南主要核心煙葉產(chǎn)區(qū)之一，烤煙栽培歷史悠久，煙葉頗受喜愛(ài)。文山州煙區(qū)多為近年來(lái)新開發(fā)的煙區(qū)。

1.2 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.2.1 土壤化學(xué)性狀

土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀含量和pH值的測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行。

1.2.2 土壤細(xì)菌DNA的提取、測(cè)序及生信分析

樣品由廣州基迪奧生物科技有限公司平臺(tái)檢測(cè)（https：//www.omicsmart.com）。采用HiPure Soil DNA Mini Kit（Magen，中國(guó)，廣州，cat#3412）進(jìn)行土壤微生物DNA 提取。然后用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA 的完整性。采用具有Barcode 標(biāo)記的引物341F

‘CCTACGGGNGGTATCTAAT’、806R‘GGACTACHVGGGTACTAAT’對(duì)細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA V3～V4 區(qū)MiSeq 擴(kuò)增子測(cè)序。PCR 采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase 聚合酶，每個(gè)樣本3 次PCR 重復(fù)，擴(kuò)增后將PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化效果。用AxyPreDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，使用Tris-HCl 洗脫，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，最后采用高通量Illumina Miseq 測(cè)序的方法，對(duì)不同連作年限煙田土壤細(xì)菌群落進(jìn)行分析。從云南曲靖、紅河、文山3 個(gè)典型產(chǎn)區(qū)60 個(gè)土壤樣本中共獲得5 846 101條有效序列，總堿基數(shù)為2 641 381 292 bp，平均長(zhǎng)度為441 bp，共獲得11 167個(gè)分類操作單元（OTUs）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用IBM Statistics SPSS 20.0 進(jìn)行方差分析。利用軟件平臺(tái)Usearch version 7.0 對(duì)相似度在97%條件下的OTU 進(jìn)行質(zhì)控拼接和Tag 聚類去嵌合體，獲得OTU的豐度和OTU 代表序列。然后利用軟件Mothur version v.1.30.1 計(jì)算反映群落豐富度（Community richness）的Sobs、Chao1、Ace 指數(shù)和反映群落多樣性的Shannon、Simpson 指數(shù)[22-23]。利用R 語(yǔ)言工具進(jìn)行群落柱狀圖的統(tǒng)計(jì)、繪制，以及冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作年限對(duì)煙田土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

云南3 個(gè)典型煙區(qū)不同連作煙田土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀含量和pH 值檢測(cè)結(jié)果見表1。從表1 可以看出，與對(duì)照相比，隨連作年限的增加，曲靖煙區(qū)土壤pH 值極顯著（P＜0.01）降低，連作2、4 a和8 a 及以上pH 值分別降低0.7、0.4 和0.5 個(gè)單位，紅河煙區(qū)土壤pH 值顯著（P＜0.05）降低（除連作2 a 土壤外），分別降低0.1、0.5、0.6個(gè)單位，文山煙區(qū)pH升高，分別上升0.1、0.4、0.5 個(gè)單位。曲靖煙區(qū)不同連作年限煙田土壤有機(jī)質(zhì)含量差異不顯著，對(duì)照最低，紅河州煙區(qū)連作2、4、8 a及以上土壤有機(jī)質(zhì)含量均極顯著（P＜0.01）高于對(duì)照，文山煙區(qū)連作2 a 土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著（P＜0.05）低于對(duì)照。土壤堿解氮含量整體呈增加趨勢(shì)，相較于對(duì)照，曲靖煙區(qū)連作2 a 和8 a 及以上土壤堿解氮含量增幅分別為12.0%和44.0%，連作4 a土壤堿解氮含量降幅為10.0%，紅河煙區(qū)增幅分別為86.7%、174.8%、171.8%，文山煙區(qū)連作4 a 和8 a 及以上增幅分別為32.8%、65.2%，連作2 a 土壤堿解氮含量降幅為17.2%。曲靖煙區(qū)連作8 a 及以上煙田土壤的有效磷含量均極顯著（P＜0.01）高于其他連作年限煙田土壤，紅河和文山煙區(qū)連作4 a 煙田土壤有效磷含量均極顯著（P＜0.01）高于其他處理。相較于對(duì)照，3 個(gè)生態(tài)煙區(qū)的3 種連作年限煙田土壤速效鉀含量均極顯著（P＜0.01）增加，曲靖煙區(qū)連作8 a及以上、紅河煙區(qū)連作4 a、文山煙區(qū)連作2 a 土壤速效鉀含量最高。以上結(jié)果說(shuō)明，連作煙田土壤主要化學(xué)性質(zhì)存在空間異質(zhì)性。

表1 不同連作年限煙田土壤化學(xué)性質(zhì)特征Table 1 Characteristic of soil chemical properties of tobacco fields with different continuous cropping years

2.2 連作對(duì)煙田土壤細(xì)菌OTU的影響

Venn 圖能夠反映組間或樣品之間共有或特有OTU，能夠直觀地反映出組間或樣品間OTU的重疊情況。由圖1可知，與對(duì)照相比，曲靖煙區(qū)3種連作煙田土壤所獲得的細(xì)菌OTU均增加，其中連作4 a和8 a及以上煙田土壤共有OTU數(shù)最多，連作2 a和4 a土壤共有OTU 數(shù)次之；紅河煙區(qū)連作2 a 土壤細(xì)菌OTU 多于對(duì)照，連作4 a和8 a及以上煙田土壤共有細(xì)菌OTU數(shù)少于對(duì)照；隨連作年限的增加，文山煙區(qū)煙田土壤細(xì)菌OTU呈增加趨勢(shì)，連作4 a和8 a及以上土壤共有細(xì)菌OTU 數(shù)最多。與對(duì)照相比，曲靖煙區(qū)3種連作年限煙田土壤特有OTU 數(shù)整體呈增加趨勢(shì)，增幅分別為23.3%、220.8%、39.4%；紅河煙區(qū)3種連作年限煙田土壤特有OTU 數(shù)呈降低趨勢(shì)，降幅分別為24.3%、53.9%、49.0%；文山煙區(qū)連作2 a 和4 a 的煙田土壤特有OTU 降幅分別為34.7%、9.3%，連作8 a及以上土壤特有OTU 數(shù)增加54.7%。說(shuō)明不同生態(tài)區(qū)中，連作土壤細(xì)菌物種豐度及特有細(xì)菌豐度存在差異，整體表現(xiàn)為連作4 a和8 a及以上土壤共有細(xì)菌OTU數(shù)最多。

圖1 不同生態(tài)煙區(qū)連作煙田土壤細(xì)菌Venn圖Figure 1 Venn diagrams of bacterial community in continuous cropping tobacco soils of Yunnan Province

2.3 連作對(duì)煙田土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

不同生態(tài)區(qū)連作煙田土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度存在差異（表2）。由表2 可知，曲靖煙區(qū)3 種連作年限煙田土壤Ace和Chao1指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于對(duì)照，連作4 a 土壤Shannon 和Simpson 指數(shù)均最高，其中Shannon指數(shù)極顯著（P＜0.01）高于0、2 a和8 a及以上煙田土壤，處理間Simpson 指數(shù)和Sobs 指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但均高于對(duì)照；紅河煙區(qū)連作2 a煙田土壤細(xì)菌Sobs、Ace 和Chao1 指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于對(duì)照和連作4、8 a 及以上土壤，對(duì)照和連作2 a土壤細(xì)菌的Shannon和Simpson指數(shù)明顯高于連作4 a 和8 a 及以上土壤；文山煙區(qū)連作8 a 及以上煙田土壤的Sobs、Ace 和Chao1 指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于對(duì)照和連作2、4 a 煙田土壤，整體呈現(xiàn)出隨連作年限增加而升高的趨勢(shì)。文山煙區(qū)連作4、8 a及以上年限土壤細(xì)菌的Shannon 指數(shù)極顯著（P＜0.01）高于對(duì)照和連作2 a 土壤，Simpson 指數(shù)則達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表2 不同連作年限煙田土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性Table 2 Community richness and diversity of soil bacterial community in tobacco field with different continuous cropping years

2.4 連作對(duì)煙田土壤細(xì)菌群落組成的影響

從圖2可以看出，門水平上，云南3個(gè)典型煙區(qū)不同連作年限土壤樣本中檢出10 個(gè)主要細(xì)菌門類（94.32%～99.31%）。曲靖煙區(qū)土壤細(xì)菌相對(duì)豐度前10 的優(yōu)勢(shì)菌門分別為變形菌門（Protecobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、裝甲菌門（Armatimonadetes）；紅河煙區(qū)土壤細(xì)菌相對(duì)豐度前10 的優(yōu)勢(shì)菌門分別為放線菌門、變形菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、疣微菌門、裝甲菌門、厚壁菌門；文山煙區(qū)土壤細(xì)菌相對(duì)豐度前10 的優(yōu)勢(shì)菌門分別為變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、疣微菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、裝甲菌門。

圖2 在門水平上連作煙田土壤細(xì)菌群落組成和相對(duì)豐度Figure 2 Composition and relative abundance of continuous cropping soil bacteria community at the phylum level

從表3 可知，隨連作年限的延長(zhǎng)，曲靖煙區(qū)煙田土壤綠彎菌門、酸桿菌門群落相對(duì)豐度整體呈減少趨勢(shì)，芽單胞菌門、浮霉菌門、厚壁菌門和裝甲菌門群落相對(duì)豐度整體呈增加趨勢(shì)，其中連作4 a和8 a及以上煙田土壤綠彎菌門群落相對(duì)豐度均顯著（P＜0.05）低于對(duì)照和連作2 a 煙田土壤；紅河煙區(qū)對(duì)照土壤放線菌門、酸桿菌門和裝甲菌門群落相對(duì)豐度均極顯著（P＜0.01）高于3 種連作土壤。隨種植年限的延長(zhǎng)，紅河煙區(qū)煙田土壤芽單胞菌門群落相對(duì)豐度呈極顯著（P＜0.01）增加趨勢(shì)，連作2 a和4 a煙田土壤的放線菌門、變形菌門、浮霉菌門、裝甲菌門群落相對(duì)豐度變化規(guī)律不明顯；隨連作年限的延長(zhǎng)，文山煙區(qū)煙田土壤放線菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門群落相對(duì)豐度整體呈明顯增加趨勢(shì)，其中，綠彎菌門、酸桿菌門和裝甲菌門群落豐度則整體呈降低趨勢(shì)。

表3 在門水平上土壤細(xì)菌群落組成差異分析（%）Table 3 Composition and relative abundance of bacteria community at the phylum level（%）

2.5 連作煙田土壤化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌群落關(guān)聯(lián)分析

從圖3a 可以看出，屬水平上，第一排序軸貢獻(xiàn)率為56.10%，第二排序軸貢獻(xiàn)率為30.02%，累積解釋變異量達(dá)到86.12%，說(shuō)明排序軸很好地反映了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和土壤化學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系。從圖3a 中可以看出，pH 值和速效鉀含量與連作土壤細(xì)菌物種分布呈正相關(guān)，有機(jī)質(zhì)和有效磷含量與土壤細(xì)菌物種分布呈負(fù)相關(guān)，堿解氮與土壤細(xì)菌物種分布無(wú)相關(guān)性。從圖3b可以看出，在門水平上，皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析表明，土壤pH 值與放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、棒狀桿菌門（Rokubacteria）、硝化螺旋菌門、迷蹤菌門（Elusimicrobia）群落分布呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。有機(jī)質(zhì)含量與浮霉菌門和棒狀桿菌門群落分布呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與放線菌門群落分布呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。堿解氮僅與硝化螺旋菌門（Nitrospirae）群落分布呈顯著相關(guān)。有效磷含量與芽單胞菌門、厚壁菌門群落分布呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與疣微菌門、裝甲菌門、棒狀桿菌門和硝化螺旋菌門群落分布呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。速效鉀含量與放線菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門群落分布呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與綠彎菌門和迷蹤菌門群落分布呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

圖3 環(huán)境因子與土壤細(xì)菌群落的冗余分析和相關(guān)性熱圖分析Figure 3 RDA and correlation heat map analysis of environmental factors and soil bacterial community

3 討論

3.1 連作對(duì)煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響

研究表明，長(zhǎng)期連作嚴(yán)重影響了土壤理化性狀，進(jìn)而顯著降低了土壤細(xì)菌群落和組成多樣性[13]。本研究中，云南3 個(gè)典型煙區(qū)連作土壤細(xì)菌多樣性及豐富度特征存在空間異質(zhì)性和時(shí)間異質(zhì)性。曲靖煙區(qū)連作4 a、紅河煙區(qū)連作2 a、文山煙區(qū)連作8 a 及以上土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性最高，說(shuō)明不同生態(tài)區(qū)連作煙田土壤樣本組成表現(xiàn)出不同的聚集性。胡元森等[24]、王佩雯等[15]的研究認(rèn)為，土壤細(xì)菌群落是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的系統(tǒng)，連作或施肥等條件很可能只影響某些種群的豐度。施肥很可能是從細(xì)菌群落的豐度上影響群落，進(jìn)而影響土壤微生物的富集，而沒(méi)有改變?nèi)郝浞N類[15]。本試驗(yàn)中，烤煙連作煙田土壤細(xì)菌群落豐富度均高于對(duì)照土壤，說(shuō)明連作導(dǎo)致某些土壤病原菌的積累，或者可能與實(shí)際生產(chǎn)中煙農(nóng)補(bǔ)充外源菌以及施肥水平等管理因素有關(guān)，因此連作土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性提高可能是多種因素共同作用的結(jié)果，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 連作對(duì)煙田土壤細(xì)菌群落組成的影響

王佩雯等[15]的研究認(rèn)為，連作植煙土壤細(xì)菌群落易受環(huán)境變化的影響，表現(xiàn)出一定的時(shí)間差異性。連作土壤的細(xì)菌菌群在大田期變化較大，致病菌增多[25]。這可能是連作土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度提高的主要原因之一。本研究結(jié)果表明，在門水平上所檢出的前10 位的細(xì)菌門類（相對(duì)豐度94.32%～99.31%）中，曲靖、紅河、文山3 個(gè)生態(tài)煙區(qū)煙田土壤細(xì)菌門類表現(xiàn)出空間上的異質(zhì)性，相同生態(tài)區(qū)不同連作年限煙田土壤優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度也存在異質(zhì)性。曲靖煙區(qū)和文山煙區(qū)變形菌門群落相對(duì)豐度最高，紅河煙區(qū)放線菌門群落相對(duì)豐度最高。變形菌門是最為普遍的細(xì)菌菌門[26]，同時(shí)包含了大量的動(dòng)植物致病菌[27]。絕大多數(shù)放線菌為腐生菌，但少數(shù)寄生性放線菌能引起某些動(dòng)植物的病害[28]。隨著連作年限的延長(zhǎng)，曲靖煙區(qū)煙田土壤綠彎菌門群落相對(duì)豐度顯著（P＜0.05）減少，酸桿菌門群落相對(duì)豐度整體呈減少趨勢(shì)，芽單胞菌門、浮霉菌門、厚壁菌門和裝甲菌門相對(duì)豐度整體呈增加趨勢(shì)；紅河煙區(qū)煙田土壤芽單胞菌門相對(duì)豐度呈極顯著（P＜0.01）增加趨勢(shì)；文山煙區(qū)煙田土壤放線菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門相對(duì)豐度整體呈極顯著（P＜0.01）增加趨勢(shì)，綠彎菌門和酸桿菌門細(xì)菌相對(duì)豐度則整體呈顯著（P＜0.05）降低趨勢(shì)，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間異質(zhì)性。尤垂淮等[29]的研究認(rèn)為，重茬導(dǎo)致土壤酚酸物質(zhì)富集，進(jìn)而促進(jìn)了以酚酸為底物的微生物生長(zhǎng)，因而病原微生物增加。說(shuō)明連作導(dǎo)致細(xì)菌群落組成發(fā)生變化，但連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)區(qū)域異質(zhì)性是否與施肥、氣候等因素有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

3.3 連作土壤主要理化性質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤為細(xì)菌群落的生長(zhǎng)繁殖提供重要的微環(huán)境，種植模式會(huì)改變其微環(huán)境，間接影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成。JAN 等[30]認(rèn)為RDA 可以分析解釋變量和多個(gè)響應(yīng)變量之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，在幾種主要的理化因子中，pH 值對(duì)細(xì)菌物種分布影響最大，磷素影響次之，而氮素?zé)o相關(guān)性。這與NACKE 等[31]的研究結(jié)論一致，該研究發(fā)現(xiàn)土壤pH 值是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要因子。這可能與連作土壤出現(xiàn)磷素積累，反而成為限制因子有關(guān)。試驗(yàn)中，與對(duì)照土壤相比，曲靖煙區(qū)和紅河煙區(qū)連作煙田土壤pH 值均隨連作年限延長(zhǎng)而降低，這與婁翼來(lái)等[32]的研究結(jié)論一致，該研究發(fā)現(xiàn)隨著植煙年限的延長(zhǎng)，表層和次表層土壤的pH 值均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)，重茬5 年后表層土壤酸化明顯。而與對(duì)照土壤相比，文山煙區(qū)pH值則呈小幅增加趨勢(shì)，這可能與該煙區(qū)習(xí)慣施用生石灰有關(guān)。土壤酸堿度決定土壤細(xì)菌豐度和多樣性，因?yàn)閜H 值對(duì)某些土壤細(xì)菌表現(xiàn)出生理限制，而有些細(xì)菌則能更好地適應(yīng)土壤酸化帶來(lái)的脅迫[33]，也有可能是由于土壤的酸堿度雖不能直接改變細(xì)菌群落，但可以作為一種整體的綜合變量，推動(dòng)微生物區(qū)系組成的變化[34]。生產(chǎn)實(shí)踐中可通過(guò)添加生石灰，增加農(nóng)家肥、有機(jī)肥的施用量調(diào)控土壤pH值和磷素水平，從而改良連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，改善連作土壤微環(huán)境。

4 結(jié)論

（1）云南3 個(gè)典型煙區(qū)連作煙田土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度、多樣性及群落組成存在空間異質(zhì)性和時(shí)間異質(zhì)性。

（2）隨著連作年限的延長(zhǎng)，土壤細(xì)菌群落發(fā)生不同程度的結(jié)構(gòu)性變化。

（3）在連作煙田土壤改良時(shí)加強(qiáng)土壤pH 值和有效磷含量調(diào)控是關(guān)鍵。