田雪珂, 肖桂然

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

果蠅作為四大經(jīng)典模式生物之一,其飼養(yǎng)容易、生長(zhǎng)周期短,后代多,有利于數(shù)據(jù)的采集和大規(guī)模試驗(yàn)的進(jìn)行。作為動(dòng)物模型,果蠅遺傳背景清楚,操作簡(jiǎn)單成熟,引入了酵母中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,即Gal4-UAS系統(tǒng)。Gal4-UAS系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)果蠅體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的常用手段,該系統(tǒng)由Gal4(driver)和UAS(responder)2個(gè)調(diào)控元件組成,分別存在于2種轉(zhuǎn)基因果蠅中,2種果蠅雜交產(chǎn)生的后代同時(shí)含有這2個(gè)元件,Gal4結(jié)合到UAS序列上,啟動(dòng)UAS下游基因細(xì)胞的組織特異性表達(dá)[1],這是哺乳動(dòng)物望塵莫及的,被廣泛應(yīng)用于遺傳、發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)學(xué)等各種基礎(chǔ)研究。

Catsup基因在早期研究中曾被認(rèn)為是兒茶酚胺生物合成過程中酪氨酸羥化酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子,兒茶酚胺是一種由突觸小泡負(fù)荷并參與多巴胺釋放的化學(xué)物質(zhì),在果蠅中該物質(zhì)還參與睡眠行為的控制[2-3]。生物信息學(xué)分析顯示, Catsup 和鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ZIP 家族成員hZIP7高度同源,其編碼的蛋白極可能是一個(gè)定位在高爾基體上的轉(zhuǎn)鋅蛋白[4-5],但是目前對(duì)于該基因的分子功能及結(jié)構(gòu)還缺乏研究。

熒光蛋白是一系列在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生熒光的生物發(fā)光蛋白,以其熒光穩(wěn)定性好、靈敏度高、無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。熒光蛋白主要包括綠色、黃色和紅色 3 種顏色,綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)最初從水母(Scyphozoa)中分離,文獻(xiàn)[5]從不發(fā)光的海洋生物群克隆到了GFP基因,可在細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物中廣譜表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光;黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)最初來(lái)自維多利亞多管水母(Aequoriavictoria),發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm,是GFP的一種突變體;紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)最初從珊瑚蟲中分離,發(fā)射波長(zhǎng)為583 nm,是GFP的同源熒光蛋白。這3種熒光蛋白常作為報(bào)告基因或者追蹤基因,被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[6-8]。

為了鑒定果蠅Catsup的分子功能,需要確定其亞細(xì)胞定位,本文構(gòu)建了Catsup與GFP融合表達(dá)載體,通過顯微注射進(jìn)入果蠅中,構(gòu)建UAS-Catsup-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅,利用熒光顯微鏡觀察了Catsup的亞細(xì)胞定位,確定其定位在高爾基上。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌、質(zhì)粒及轉(zhuǎn)基因果蠅

大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α購(gòu)于北京全式金公司; pUAST質(zhì)粒、Golgi-mRFP果蠅由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周兵實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑

EasyTaq DNA Polymerase、EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ和Not Ⅰ限制性快速內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、T4 DNA Ligase buffer、dNTP mix、Trans2K Plus DNA Marker、6×DNA loading buffer均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、氨芐青霉素均購(gòu)于北京普利萊公司;無(wú)菌水、瓊脂糖、1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠儲(chǔ)存液均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)于北京勤誠(chéng)盛達(dá)科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)于上海智城分析儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于Beckman Coulter, USA;超低溫冰箱購(gòu)于Thermo Fisher scientific;凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于上海天能科技有限公司;熒光顯微鏡購(gòu)于尼康映像儀器銷售有限公司;基因擴(kuò)增儀、恒溫培養(yǎng)振蕩器、脫色搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、微量移液器等。

1.1.4 引物及測(cè)序

引物和測(cè)序報(bào)告均由上海生工生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

(1) LB液體培養(yǎng)基的配制。稱取1 g蛋白胨,0.5 g酵母粉及1 g NaCl,加入80 mL ddH2O,用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.2,定容至100 mL,121 ℃高壓滅菌20 min。

(2) LB固體培養(yǎng)基的配制。100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入1.2 g瓊脂粉,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 Catsup-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.2.1 目的基因的獲得

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)所需引物,所需引物為:

FP:5’CATgaattcCAAAATGGCCAAACAAGTGG;RP:5’CATgtcgacCTCGAACTTGGCGATAACG。

從pcDNA3.1-hzip13-EGFP上切下來(lái)GFP[9]。以cDNA為模板,用高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增。

1.2.2.2 pUAST-Catsup-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收的Catsup目的基因用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ在37 ℃下進(jìn)行雙酶切。pUAST vector用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切。EGFP用Sal Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切。用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。將連接過夜的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,用含有100 mg/mL氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。挑取長(zhǎng)勢(shì)正常的單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定,并用200 mg/mL IPTG誘導(dǎo)劑37 ℃誘導(dǎo)4 h,對(duì)表達(dá)菌表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性測(cè)量。

1.2.3 Catsup-GFP細(xì)胞的亞細(xì)胞定位

將得到的pUAST-Catsup-GFP表達(dá)載體驗(yàn)證正確后通過顯微注射技術(shù)導(dǎo)入果蠅,得到不同Catsup-GFP插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因果蠅。將該轉(zhuǎn)基因果蠅與全身特性表達(dá)的driver-Daughterless雜交,待其長(zhǎng)至3齡,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增電泳驗(yàn)證得到Catsup-GFP果蠅。用驗(yàn)證后的Catsup-GFP果蠅挑紅眼與腸細(xì)胞特異表達(dá)的driver-NP3084雜交,待幼蟲長(zhǎng)至3齡解剖,用熒光顯微鏡看其亞細(xì)胞定位,初步確定Catsup定位在高爾基上。用高爾基體上特異性表達(dá)的果蠅Golgi-GFP與driver-NP3084雜交,待幼蟲長(zhǎng)至3齡,用熒光顯微鏡觀察是否與Catsup-GFP的亞細(xì)胞定位重合, 確定Catsup是否定位在高爾基體上。

2 結(jié)果與分析

2.1 Catsup基因的擴(kuò)增

以果蠅cDNA為模板擴(kuò)增Catsup基因片段,如圖1所示,圖1中,M為DNA Marker;1為Catsup基因。由圖1可知,樣品PCR擴(kuò)增出了DNA片段,且在2 000 bp有一條明顯的特異性條帶。與期望得到的Catsup結(jié)構(gòu)基因片段相符,表明擴(kuò)增出了目的基因片段。

圖1 PCR擴(kuò)增目的片段

2.2 Catsup-GFP表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及鑒定

將PCR擴(kuò)增出的Catsup目的基因、pcDNA3.1-hzip13-EGFP上切下來(lái)GFP和空載pUAST分別用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,用T4 DNA連接酶于16 ℃金屬浴中過夜連接,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中,用含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng),篩選陽(yáng)性單克隆如圖2所示,由圖2可知,大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形。邊緣整齊，表面光滑,半透明,小凸起。可以判斷平板上生長(zhǎng)的是大腸桿菌,且未被雜菌污染。

圖2 轉(zhuǎn)化后的克隆載體大腸桿菌

挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并電泳檢測(cè),Catsup-GFP過表達(dá)菌株的菌落的PCR鑒定結(jié)果如圖3所示,圖3中,M為DNA Marker;1～16為隨機(jī)挑取的菌落。由圖3可知,所有單菌落均顯示陽(yáng)性條帶。但可能由于制膠原因,部分條帶顯示小于預(yù)期的2 000 bp。

圖3 菌落PCR的電泳圖

2.3 Catsup-GFP質(zhì)粒PCR驗(yàn)證

從陽(yáng)性克隆中選取1號(hào)提取質(zhì)粒，選取Catsup N端載體引物及GFP R端引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示,圖4中,M為DNA Marker;1為Catsup基因。已知Catsup大小為1 350 bp,GFP大小為726 bp,由圖4可知,樣品PCR擴(kuò)增出了2 000 bp DNA片段,表明Catsup-GFP質(zhì)粒連接成功。

圖4 Catsup-GFP雙酶切電泳圖

Catsup-GFP質(zhì)粒連接成功的載體進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果反饋序列正確,表明成功構(gòu)建了能在果蠅中進(jìn)行表達(dá)的pUAST-Catsup-GFP質(zhì)粒。

2.4 Catsup-GFP果蠅的構(gòu)建

將驗(yàn)證成功的Catsup-GFP質(zhì)粒纖維注射野生型果蠅w1118(眼睛白色),得到不同插入位點(diǎn)的Catsup-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅,因?yàn)閜UAST載體具有白眼基因,所以成功轉(zhuǎn)基因果蠅的眼睛呈紅色。取紅色眼睛轉(zhuǎn)基因果蠅與平衡子進(jìn)行雜交,進(jìn)行染色體驗(yàn)證及純化。共獲取3株UAS-Catsup-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅。

用得到的轉(zhuǎn)基因果蠅和全身表達(dá)的Gal4雜交,待其長(zhǎng)至3齡提全蟲的RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行電泳檢測(cè),選取Catsup N端載體引物及GFP R端引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),如圖5所示。圖5中,1、2、3代表Catsup-GFP質(zhì)粒隨機(jī)注射果蠅后得到的3種不同插入位置的Catsup-GFP果蠅。由圖5可知,Catsup-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因果蠅構(gòu)建成功。

圖5 Catsup果蠅驗(yàn)證結(jié)果

2.5 果蠅Catsup亞細(xì)胞定位分析

為了鑒定Catsup的亞細(xì)胞定位,將驗(yàn)證成功的Catsup-GFP果蠅和高爾基體上特異性表達(dá)的Golgi-GFP果蠅分別與腸細(xì)胞特異表達(dá)的driver-NP3084雜交,待幼蟲長(zhǎng)至三齡,解剖出腸子,用熒光顯微鏡拍其亞細(xì)胞定位如圖6所示。從圖6可以看出,Catsup-GFP與Golgi-RFP完全重合,表明Catsup定位在了高爾基上。

圖6 Catsup亞細(xì)胞定位

3 結(jié) 論

有研究推斷,Catsup與細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、睡眠以及乳腺癌的發(fā)生發(fā)展等均有關(guān)[10]。但是, Catsup的分子功能還未確定,它在很多器官中的功能尚未可知[11]。生物信息學(xué)分析顯示,Catsup編碼的蛋白極可能是一個(gè)定位在高爾基體上的轉(zhuǎn)鋅蛋白。為了確定Catsup的亞細(xì)胞定位,并解析其作用機(jī)制，本文利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Catsup基因,從pcDNA3.1-hzip7-EGFP酶切下GFP,經(jīng)雙酶切后將它們一起連接在pUAST質(zhì)粒上,導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)測(cè)序獲得構(gòu)建成功的載體。隨后,本文將此載體通過顯微注射技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅,利用遺傳技術(shù)獲取轉(zhuǎn)基因成功的果蠅,并分析轉(zhuǎn)基因的染色體位置。選取該轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行定位分析,發(fā)現(xiàn)Catsup是一個(gè)定位在高爾基體上的蛋白,因此Catsup在分泌途徑中起作用,為后續(xù)關(guān)于Catsup的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。