張方梅, 閆 藝, 程登發(fā), 朱 勛, 張?jiān)苹?*, 李祥瑞,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院, 河南信陽(yáng) 464000)

麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavenae是我國(guó)糧食種植區(qū)小麥蚜蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種，現(xiàn)在被認(rèn)為是荻草谷網(wǎng)蚜，主要通過(guò)取食韌皮部汁液、分泌蜜露、傳播植物病毒等方式危害小麥，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)(Fuetal., 2014; Liuetal., 2014; Honeketal., 2017)。蚜蟲(chóng)具備典型的表型可塑性，當(dāng)外界環(huán)境條件變化時(shí)，蚜蟲(chóng)呈現(xiàn)兩種不同的形態(tài)：有翅型和無(wú)翅型(Taguetal., 2005; Braendleetal., 2006)。蚜蟲(chóng)這種表觀形態(tài)的變化主要受溫度、密度和食物質(zhì)量等環(huán)境因子的脅迫，通過(guò)選擇性地調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)(Brissonetal., 2010; Zhangetal., 2015)。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為22 nt左右的小分子非編碼RNA，廣泛存在于各類(lèi)生物體內(nèi)。作為一種重要的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件，通過(guò)抑制靶基因的翻譯過(guò)程或降解靶基因的mRNA而參與基因調(diào)控(Brenneckeetal., 2005; Boutla and Tabler , 2006)。目前已經(jīng)鑒定出大量與昆蟲(chóng)翅發(fā)育相關(guān)的miRNA。例如，德國(guó)小蠊BlattellagermanicaLet-7和miR-100同時(shí)下調(diào)引起翅發(fā)育畸形，而miR-100單獨(dú)下調(diào)時(shí)則導(dǎo)致翅面積減小(Rubioetal., 2012)。果蠅DrosophilamiR-iab-4及其反義鏈miR-iab-8通過(guò)抑制超級(jí)雙胸基因Ubx的活性，控制其翅與平衡棒之間的轉(zhuǎn)換(Ronshaugenetal., 2005; Starketal., 2008; Tyleretal., 2008)；miR-12和miR-283則通過(guò)調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路引起翅發(fā)育畸形(Friggi-Grelinetal., 2008)。鱗翅目特異的miR-2768靶向翅脈中斷(ci)基因的編碼區(qū)，在翅原基發(fā)育中發(fā)揮作用(Quahetal., 2015)；miR-263a參與調(diào)控翅鱗片細(xì)胞的形成(Surridgeetal., 2011)。在東亞飛蝗Locustamigratoria中，miR-133通過(guò)調(diào)控多巴胺合成途徑中的關(guān)鍵靶標(biāo)基因henna和pale，導(dǎo)致散居型和群居型之間表型可塑性和行為變化(Yangetal., 2014)。miR-34通過(guò)調(diào)控兩個(gè)胰島素受體(InR1和InR2)，進(jìn)一步控制下游的轉(zhuǎn)錄因子FOXO，從而分別控制褐飛虱后代長(zhǎng)翅型和短翅型的發(fā)育(Xuetal., 2015; Xu and Zhang, 2017)。此外，在蚜蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)了與翅發(fā)育相關(guān)的miRNA。如在褐色桔蚜Aphiscitricidus中過(guò)表達(dá)miR-9b能夠抑制其翅的發(fā)育過(guò)程，出現(xiàn)翅卷曲或翅發(fā)育不完整的表型(Shangetal., 2020)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也已發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)或者抑制表達(dá)麥長(zhǎng)管蚜miRNA能引起其翅發(fā)育的異常(Lietal., 2021)。以上結(jié)果表明，miRNA在昆蟲(chóng)表型可塑機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

核小RNA基因U6常被選作昆蟲(chóng)miRNA內(nèi)參基因，其廣泛地表達(dá)在昆蟲(chóng)各組織和細(xì)胞中，且在多種昆蟲(chóng)miRNA的表達(dá)穩(wěn)定性篩選研究中已有諸多報(bào)道，如麥長(zhǎng)管蚜(Lietal., 2016)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Shakeeletal., 2018)、斜紋夜蛾P(guān)rodenialitura(岑永杰等, 2019)和白背飛虱Sogatellafurcifera(Changetal., 2018)等。但目前對(duì)麥長(zhǎng)管蚜U6的序列及特征尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)麥長(zhǎng)管蚜U6 cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆、分析，選擇前期測(cè)序獲得在麥長(zhǎng)管蚜成蚜兩翅型間差異表達(dá)的9個(gè)miRNA(miR-277,miR-9a,miR-7,Let-7,miR-1,miR-315,miR-8,PC-3p-2743_844和PC-5P-113190_15)，驗(yàn)證這些miRNA在兩翅型不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，界定其發(fā)揮作用的具體時(shí)期，為探索開(kāi)發(fā)麥長(zhǎng)管蚜的綠色防控技術(shù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)及樣本收集

麥長(zhǎng)管蚜成蟲(chóng)于2012年4月采自農(nóng)業(yè)部廊坊作物有害生物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站(39°30′42″N, 116°36′7″E)，在室內(nèi)已連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件：溫度(20±1)℃、相對(duì)濕度50%～70%、光周期16L∶8D，供食小麥為北京837(感蚜品種)。從養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)挑取單頭無(wú)翅成蚜，連續(xù)飼養(yǎng)3代，構(gòu)建若蚜的單克隆品系。分別收集有翅蚜和無(wú)翅蚜不同發(fā)育階段的樣本，包括偽胚胎(100頭成蚜的偽胚胎)、1齡(50頭)、2齡(40頭)、3齡(30頭)、4齡(30頭)和成蚜(20頭)(Lietal., 2021)，每組樣品取3個(gè)重復(fù)，將所有樣品于液氮速凍后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

RNA提取試劑TRI Reagent(Ambion)購(gòu)自于Invitrogen Life Technologies公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScript II RT Kit)購(gòu)自于Qiagen公司，熒光定量試劑盒(miScript SYBR Green PCR Kit)購(gòu)自于Qiagen公司。QL-902渦旋振蕩儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，5415D低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，NanoDrop2000微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Therno Scientific公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500 Fast(美國(guó)Applied Biosystems公司)，Imaging G6凝膠成像系統(tǒng)(北京鼎昊源科技有限公司)。

1.3 麥長(zhǎng)管蚜總RNA提取及cDNA的合成

取1.1節(jié)麥長(zhǎng)管蚜各發(fā)育階段有翅和無(wú)翅個(gè)體樣本各30 mg，利用Trizol法提取其各樣本的總RNA，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度，2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)其質(zhì)量。根據(jù)miScript Ⅱ RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，合成cDNA第1鏈，稀釋10倍作為模板，用于qRT-PCR反應(yīng)。

1.4 麥長(zhǎng)管蚜U6的PCR克隆

麥長(zhǎng)管蚜內(nèi)參基因U6的PCR克隆分為兩部分。據(jù)已知的非洲爪蟾XenopussiluranaU6(GenBank登錄號(hào): NR_033272.1)和黑腹果蠅DrosophilamelanogasterU6 cDNA序列(GenBank登錄號(hào): AH004871.2)，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物(表1)擴(kuò)增麥長(zhǎng)管蚜U6 cDNA的片段。反應(yīng)體系(10 μL): 2×Taq Mix 5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 1.3節(jié)的cDNA模板1 μL, RNase-free Water 3 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，60℃退火30 s，70℃延伸12 s，共35個(gè)循環(huán)。

3′端采用miRNA線性加尾法進(jìn)行RT-PCR(用Qiagen公司miScript Ⅱ RT Kit)，引物序列見(jiàn)表1。用1.3節(jié)得到的cDNA模板及引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照miScript SYBRGreen PCR Kit試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，PCR反應(yīng)體系(10 μL): 2×SYBR Green Master 5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 模板1 μL, RNase-free Water 3 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性15 min; 94℃變性15 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸34 s, 共40個(gè)循環(huán); 70℃充分延伸5 min。將PCR產(chǎn)物回收后克隆測(cè)序。利用DNAMAN軟件對(duì)麥長(zhǎng)管蚜U6的全長(zhǎng)序列進(jìn)行拼接，然后輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.5 麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA成熟序列的克隆

我們前期完成了麥長(zhǎng)管蚜兩種翅型miRNA文庫(kù)測(cè)序及分析(Lietal., 2016)，篩選出9個(gè)可能與翅型分化相關(guān)的miRNA(miR-277,miR-9a,miR-7,Let-7,miR-1,miR-315,miR-8,PC-3p-2743_844,PC-5P-113190_15)。麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA的上游引物采用Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)(表1)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.4節(jié)。利用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，再連接到pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，最后進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性克隆鑒定，送到北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

通用接頭的長(zhǎng)度61 bp(表1)，miRNA成熟序列22 nt左右，所有的miRNA的序列長(zhǎng)度均約為83 bp左右。9個(gè)miRNA在有翅和無(wú)翅成蚜中的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.6 麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA的qRT-PCR反應(yīng)

將1.3節(jié)cDNA分別進(jìn)行5倍梯度稀釋作為熒光定量的模板，檢測(cè)9個(gè)miRNA和內(nèi)參基因U6的引物特異性及擴(kuò)增效率。以模板稀釋倍數(shù)的lg值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)引物序列的特異性和擴(kuò)增效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。

按照miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)建PCR反應(yīng)體系(20 μL): 2×SYBR Green Master 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 模板1 μL, RNase-free Water 7 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性15 min; 94℃變性15 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸34 s, 共40個(gè)循環(huán)。按照儀器說(shuō)明選擇融解曲線條件，60℃升至95℃，60℃ 1 min，然后95℃ 30 s，自動(dòng)采集熒光信號(hào)。U6及所篩選的9個(gè)miRNA的定量PCR上游引物采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)(表1)，本研究所有引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。下游引物為試劑盒提供的通用引物。所有發(fā)育階段均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA在麥長(zhǎng)管蚜兩翅型不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SAS9.2(SAS Institute Inc., Cary, NC, 美國(guó))軟件，采用單因素方差分析(one-way ANOVA, LSD分析法)分析麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量在不同發(fā)育階段的差異顯著性；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量在某一發(fā)育階段的有翅型和無(wú)翅型之間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 引物擴(kuò)增特異性及擴(kuò)增效率

qRT-PCR結(jié)果顯示，9個(gè)miRNA和內(nèi)參基因U6的溶解曲線均為單峰，表明引物具有特異性，擴(kuò)增效率均在90%～104%之間，相關(guān)系數(shù)R2值均高于0.97，表明各候選基因和內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)合理，具有良好的擴(kuò)增效率和特異性，符合熒光定量分析的要求(表1)。

2.2 麥長(zhǎng)管蚜內(nèi)參基因U6 cDNA全長(zhǎng)序列的克隆與序列分析

PCR得到U6基因片段。5′端和3′端的片段大小分別為74和100 bp左右，將得到的兩段序列拼接，得到麥長(zhǎng)管蚜的U6 cDNA序列(GenBank登錄號(hào): MZ357962)，全長(zhǎng)為92 bp。

將克隆得到的麥長(zhǎng)管蚜U6 cDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登記注冊(cè)的10個(gè)物種秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans(GenBank登錄號(hào): X07829.1)、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(GenBank登錄號(hào): M24607.1)、人Homosapiens(GenBank登錄號(hào): X07425)、小鼠Musmusculus(GenBank登錄號(hào): X06980)、慶網(wǎng)蛺蝶Melitaeacinxia(GenBank登錄號(hào): JX878560.1)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(GenBank登錄號(hào): KF307745.1)、曼氏血吸蟲(chóng)Schistosomamansoni(GenBank登錄號(hào): L25920.1)、有鉤絳蟲(chóng)Taeniasolium(GenBank登錄號(hào): AF529186.1)、非洲爪蟾Xenopussilurana(GenBank登錄號(hào): NR_033272.1)和四膜蟲(chóng)Tetrahymenathermophile(GenBank登錄號(hào): X53790.1)的U6 cDNA序列進(jìn)行同源性分析，核苷酸序列一致性分別為83.5%, 88.12%, 86%, 87%, 78.26%, 89.11%, 75.42%, 89%, 80.56%和68.93%，其中與小菜蛾的最高，與四膜蟲(chóng)的最低(圖1)。

圖1 11種生物U6 cDNA的序列比對(duì)

2.3 麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA成熟序列的克隆測(cè)序

結(jié)果表明在麥長(zhǎng)管蚜的有翅和無(wú)翅成蚜中均得到9個(gè)miRNA的一條特異性片段。將目的片段DNA凝膠回收后，通過(guò)pEASY-T1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性克隆鑒定，目的片段預(yù)期在190 bp左右，之后進(jìn)行測(cè)序。克隆測(cè)序得到的序列和預(yù)測(cè)的miRNA序列吻合較好。

2.4 9個(gè)miRNA在麥長(zhǎng)管蚜兩翅型不同發(fā)育階段的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，9個(gè)miRNA在麥長(zhǎng)管蚜有翅蚜和無(wú)翅蚜偽胚胎、各齡期若蚜及成蚜中均有表達(dá)，但不同miRNA在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量不同(圖2)。大部分miRNA在偽胚胎期及若蚜期的相對(duì)表達(dá)量均較低，在成蚜期相對(duì)表達(dá)量較高，且6個(gè)miRNA(miR-277,miR-9a,miR-7,Let-7,miR-1和miR-315)在有翅成蚜中的相對(duì)表達(dá)量高于在無(wú)翅成蚜中的，有翅成蚜和無(wú)翅成蚜中的相對(duì)表達(dá)量與其他發(fā)育階段相比差異顯著(有翅蚜:FmiR-277=86.11,PmiR-277<0.001;FmiR-9a=8.23,PmiR-9a=0.0014;FmiR-7=16.12,PmiR-7<0.0001;FLet-7=25.53,PLet-7<0.0001;FmiR-1=29.49,PmiR-1<0.001;FmiR-315=17.82,PmiR-315<0.0001; 無(wú)翅蚜:FmiR-277=5.70,PmiR-277=0.0064;FmiR-9a=4.82,PmiR-9a=0.0120;FmiR-7=9.60,PmiR-7=0.0007;FLet-7=33.39,PLet-7<0.0001;FmiR-1=2.75,PmiR-1=0.042;FmiR-315=26.13,PmiR-315<0.0001)。

其中miR-277和miR-9a在有翅成蚜期的相對(duì)表達(dá)量較高，分別達(dá)到17.35±2.90和16.63±2.14，約是其若蚜期和偽胚胎期的50倍(圖2: A, B)。除miR-315外，miR-277,miR-9a,miR-7,Let-7和miR-1在成蚜期的相對(duì)表達(dá)量在兩翅型間均差異顯著(tmiR-277=8.94,PmiR-277=0.0123;tmiR-9a=10.41,PmiR-9a=0.0091;tmiR-7=11.34,PmiR-7=0.0077;tLet-7=6.22,PLet-7=0.0249;tmiR-1=41.71,PmiR-1=0.0006)。miR-9a和miR-315分別在偽胚胎和3齡若蚜期相對(duì)表達(dá)量在兩翅型間差異顯著(tmiR-9a=-3.46,PmiR-9a=0.0259;tmiR-315=-4.70,PmiR-315=0.0093)(圖2: B, F)。此外，miR-9a在無(wú)翅蚜的各個(gè)發(fā)育階段中，其偽胚胎期的相對(duì)表達(dá)量最高。

miR-8,PC-3p-2743_844和PC-5p-113190_15在無(wú)翅成蚜中的相對(duì)表達(dá)量較高。其中miR-8(圖2: G)和PC-3p-2743_844(圖2: H)在有翅成蚜和無(wú)翅成蚜期相對(duì)表達(dá)量顯著高于在其他發(fā)育階段(有翅蚜:FmiR-8=16.27,PmiR-8<0.0001;FPC-3p-2743_844=3.56,PPC-3p-2743_844=0.0333; 無(wú)翅蚜:FmiR-8=5.17,PmiR-8=0.0093;FPC-3p-2743_844=26.87,PPC-3p-2743_844<0.0001)，而PC-5p-113190_15在無(wú)翅蚜3齡若蚜期相對(duì)表達(dá)量顯著高于在其他發(fā)育階段(F=18.62,P<0.0001)(圖2: I)。miR-8在成蚜期的相對(duì)表達(dá)量在兩翅型間差異顯著(t=-6.12,P=0.0257)，PC-3p-2743_844在偽胚胎和成蚜期的相對(duì)表達(dá)量在兩翅型間差異顯著(偽胚胎:t=-2.96,P=0.0417; 成蚜期:t=-9.43,P=0.0111)。PC-5p-113190_15在3齡若蚜期的相對(duì)表達(dá)量在兩翅型間呈現(xiàn)極顯著差異(t=-12.55,P=0.0002)。

圖2 麥長(zhǎng)管蚜兩翅型不同發(fā)育階段9個(gè)miRNA的表達(dá)譜

3 討論

本研究分析了9個(gè)miRNA在麥長(zhǎng)管蚜兩翅型間、不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，其中7個(gè)miRNA(miR-277,miR-9a,miR-7,Let-7,miR-1,miR-315和miR-8)在其他昆蟲(chóng)中已經(jīng)報(bào)道可能參與昆蟲(chóng)翅發(fā)育的過(guò)程，而PC-3p-2743_844和PC-5P-113190_15是在麥長(zhǎng)管蚜中新鑒定的miRNA，本研究對(duì)其相關(guān)功能進(jìn)行了探討。此外，本研究通過(guò)克隆獲得麥長(zhǎng)管蚜U6 cDNA全長(zhǎng)序列。序列同源性分析結(jié)果表明，麥長(zhǎng)管蚜與其他昆蟲(chóng)如小菜蛾、慶網(wǎng)蛺蝶等的U6 cDNA序列一致性比較高(圖1)，表明其在昆蟲(chóng)不同種間保守性比較高。而且U6作為miRNA傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，常被用來(lái)評(píng)估m(xù)iRNA目的基因的表達(dá)(Lin and Lai, 2013; Hanetal., 2014; Gharbietal., 2015)，因此本研究選擇U6作為定量表達(dá)的內(nèi)參基因。

miRNA在不同組織、不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式不相同，還有一些僅在特定發(fā)育階段或特定的組織中表達(dá)(Liuetal., 2008)。本研究檢測(cè)的麥長(zhǎng)管蚜9個(gè)miRNA中，大部分miRNA在偽胚胎期及若蚜期的相對(duì)表達(dá)量均較低，在成蚜期相對(duì)表達(dá)量較高(圖2)，表明miRNA隨著成蚜個(gè)體miRNA表達(dá)量的增加，發(fā)揮調(diào)控作用可能集中在成蟲(chóng)階段，但這還需要通過(guò)驗(yàn)證靶基因的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)。

miR-277在有翅成蚜中相對(duì)表達(dá)量最高(圖2: A)，這種高表達(dá)現(xiàn)象在豌豆蚜Acyrthosiphonpisum中也存在(楊宗霖等, 2019)。有研究發(fā)現(xiàn)果蠅的miR-277可以通過(guò)調(diào)控Pacman控制翅原基生長(zhǎng)(Jonesetal., 2013)，也能夠抑制胰島素的信號(hào)，縮短其壽命(Esslingeretal., 2013)。在本研究結(jié)果中，miR-277無(wú)論是在有翅成蚜還是在無(wú)翅成蚜中，其相對(duì)表達(dá)量均與在其他齡期的呈現(xiàn)顯著差異；與在有翅成蚜期的相比，在無(wú)翅成蚜期的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，推測(cè)miR-277可能參與延長(zhǎng)麥長(zhǎng)管蚜有翅成蚜的壽命，這與有翅蚜長(zhǎng)距離遷飛的行為有關(guān)。此外，Xu等(2015)已經(jīng)證實(shí)，胰島素信號(hào)通路參與了褐飛虱的翅型分化，結(jié)合先前的在果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)miR-277能夠抑制果蠅胰島素的信號(hào)(Esslingeretal., 2013)，推測(cè)miR-277在蚜蟲(chóng)翅型分化中也可能起著重要的作用。

miR-9a影響果蠅翅的發(fā)育，其可通過(guò)抑制靶基因LIM-only的表達(dá)，引起果蠅翅組織缺失及異位細(xì)胞凋亡(Biryukovaetal., 2009)，也可通過(guò)抑制senseless引起其翅原基細(xì)胞凋亡(Bejaranoetal., 2010)。本研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)翅蚜中，麥長(zhǎng)管蚜的miR-9a在偽胚胎期表達(dá)量最高，且在兩翅型間差異顯著(圖2: B)。偽胚胎期是麥長(zhǎng)管蚜翅型分化敏感時(shí)期之一，易受到外界因子的影響(Ankersmit and Dijkman, 1983; Mülleretal., 2001)。組織學(xué)研究也已經(jīng)明確，在許多蚜蟲(chóng)類(lèi)群中，出生時(shí)都有一個(gè)翅原基(Braendleetal., 2006)，只是在發(fā)育成為無(wú)翅型的過(guò)程中翅原基發(fā)生退化。這從側(cè)面證明，miR-9a可能在偽胚胎時(shí)期就開(kāi)始對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控，使其朝向無(wú)翅蚜方向發(fā)育。目前有研究已經(jīng)證實(shí)，在褐色桔蚜中miR-9a同源基因miR-9b負(fù)向調(diào)控ABCG4的表達(dá)，ABCG4通過(guò)調(diào)控IRP3的表達(dá)影響胰島素信號(hào)通路的活性從而調(diào)控其翅的發(fā)育(Shangetal., 2020)，這進(jìn)一步為miR-9a在麥長(zhǎng)管蚜翅型發(fā)育中的作用提供了依據(jù)。

Legeai等(2010)在豌豆蚜中研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)翅雌性蚜相比，Let-7和miR-100在有翅僑遷蚜中的表達(dá)是上調(diào)的，這與本研究結(jié)果一致。本研究也發(fā)現(xiàn)麥長(zhǎng)管蚜Let-7在無(wú)翅成蚜中的表達(dá)是下調(diào)的，且在兩翅型間差異顯著(圖2: D)，表明Let-7可能在麥長(zhǎng)管蚜表型差異中起著非常重要的作用，這進(jìn)一步表明miRNA在不同種的蚜蟲(chóng)間保守性較高，表達(dá)趨勢(shì)也基本一致。蛻皮激素信號(hào)通路也在昆蟲(chóng)多型性分化中發(fā)揮重要作用(Zhang CXetal., 2019；Zhang RJetal., 2019)。已有研究證實(shí)，在家蠶Bombyxmori和果蠅中Let-7通過(guò)直接或間接方式參與昆蟲(chóng)的蛻皮調(diào)控，抑制其表達(dá)后不能正常蛻皮(Lingetal., 2014)，或抑制成蟲(chóng)背腹部的神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育(Caygill and Johnston, 2008)。而對(duì)于麥長(zhǎng)管蚜來(lái)說(shuō)，Let-7是否影響其蛻皮過(guò)程，還需要后期深入研究。

此外，miR-1,miR-7,miR-8和miR-315也都通過(guò)不同方式參與了昆蟲(chóng)翅發(fā)育的調(diào)控。如miR-1可能參與了蝗蟲(chóng)胸部飛行肌和翅的發(fā)育(Weietal., 2009)，抑制果蠅miR-7的表達(dá)，可引起翅體積的減小(Aparicioetal., 2015)，miR-8控制其翅色素沉積和羽化(Kennelletal., 2012)，miR-315是翅發(fā)育wingless的信號(hào)調(diào)控者(Silveretal., 2007)，這些與翅發(fā)育相關(guān)的miRNA均都能注釋到豌豆蚜的基因組中(Brissonetal., 2010)，且其中的一些miRNA在桃蚜Myzuspersicae的兩翅型間也差異表達(dá)(Ghanimetal., 2006)。此外，通過(guò)干擾miR-2,miR-306和miR-14的表達(dá)均引起麥長(zhǎng)管蚜翅畸形發(fā)育(Lietal., 2021)。以上結(jié)果均表明miRNA在麥長(zhǎng)管蚜翅發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不可忽視的作用。

本研究篩選出的與蚜蟲(chóng)翅型分化相關(guān)的9個(gè)miRNA在兩翅型不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。根據(jù)結(jié)果推測(cè)，這些差異或特異表達(dá)的miRNA可能在偽胚胎或成蟲(chóng)階段對(duì)蚜蟲(chóng)翅型發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，但具體靶向哪個(gè)基因，參與哪個(gè)調(diào)控通路，值得進(jìn)一深入研究。