華冰清，管鵬鵬，桂利權(quán)，沈周高，張愛嘉，陶玲玲，朱俊彥，韋朝領(lǐng)，劉升銳*

安徽省三個‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜構(gòu)建

華冰清1，管鵬鵬1，桂利權(quán)2，沈周高1，張愛嘉1，陶玲玲1，朱俊彥1，韋朝領(lǐng)1，劉升銳1*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與茶葉加工重點實驗室，安徽合肥 230036；2.謝裕大茶葉股份有限公司，安徽合肥 230036)

本研究篩選了6個多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為一個核心標(biāo)記組，對‘黃山白茶’三個特異茶樹品種（系）及其余43份茶樹品種（系）進(jìn)行基因分型，根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小構(gòu)建了三個‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜。結(jié)果表明，6個標(biāo)記擴(kuò)增條帶清晰，不同樣品間具有較好的多態(tài)性，共擴(kuò)增出等位基因數(shù)26個，平均為4.33；主效等位基因頻率為0.283～0.370，均值為0.335；觀測雜合度和期望雜合度均值分別為0.571和0.613；多態(tài)性信息含量為0.700～0.786，平均為0.740。根據(jù)等位基因片段大小分別構(gòu)建了‘黃山白茶1號’品種、‘黃山白茶2號’品系和‘黃山白茶3號’品系的分子指紋圖譜，為‘黃山白茶’種質(zhì)資源鑒定、品種保護(hù)和推廣利用提供重要理論依據(jù)。

黃山白茶；SSR標(biāo)記；遺傳多態(tài)性；分子指紋

我國茶樹種質(zhì)資源豐富多樣，其中新梢葉色白化茶樹品種是重要的特異資源，因其對氣候因子敏感程度不同，可分為溫度敏感型和光照敏感型[1]?！S山白茶’（‘Huangshan Baicha’）原產(chǎn)于安徽省歙縣境內(nèi)的新安江支流，因產(chǎn)地居古徽州府所轄，故又名‘徽州白茶’[2]，屬于溫度敏感型白化茶樹變種[3]，其春茶芽葉呈玉白色，隨著春季氣溫升高和芽葉變大，由葉片主脈、支脈、葉肉細(xì)胞依次返綠，葉色逐漸變成黃白色、黃綠色、淺綠色，夏秋茶則為綠色[3,4]。其制成的干茶色澤略顯金黃、沖泡湯色明亮、香高持久、滋味鮮爽，游離氨基酸含量較高，且富含人體所需的硒、鐵、鋅等多種微量元素，兼具飲用與觀賞價值，備受廣大消費者青睞[4-6]。目前，通過短穗扦插繁育的無性系‘黃山白茶1號’品種（安徽省省級良種）、‘黃山白茶2號’品系和‘黃山白茶3號’品系已推廣種植?，F(xiàn)今，全國各地已選育出大量不同類型的白化茶樹品種，僅通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定難以區(qū)分，且對于溫度敏感型白化茶樹品種夏秋季返綠后與其它品種更加難以區(qū)分，為茶樹資源保護(hù)和品種鑒別帶來了一定的困難和挑戰(zhàn)[7]。

分子標(biāo)記技術(shù)是從DNA水平上對物種的遺傳特性進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、不受環(huán)境影響。SSR（Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、且基因組分布廣泛等優(yōu)點，是茶樹遺傳研究中最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一[8,9]。目前，SSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建茶樹品種分子指紋。如章志芳和馬建強(qiáng)利用10個EST-SSR標(biāo)記對14個茶樹新品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并構(gòu)建了各自特異的DNA分子指紋圖譜[10]；Tan等從30個標(biāo)記中篩選了8個標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，并構(gòu)建了128份茶樹品種的分子指紋圖譜[11]；Liu等從36個SSR標(biāo)記中篩選了5個多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，并構(gòu)建了80個茶樹品種（品系）的分子指紋圖譜[12]；阮旭等利用篩選的50對SSR標(biāo)記對安徽省各個茶區(qū)共68份茶樹品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，并選出8對核心標(biāo)記組構(gòu)建了其各自特異的分子指紋圖譜[13]；Guo等選用了6個SSR標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，構(gòu)建了126份廣西茶樹種質(zhì)資源的分子指紋圖譜[14]。

本研究以課題組先前開發(fā)的SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)，進(jìn)一步篩選了6個多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記，將其作為核心標(biāo)記組，對46份茶樹品種（系）進(jìn)行了快速的基因分型，構(gòu)建了‘黃山白茶1號’‘黃山白茶2號’和‘黃山白茶3號’品種（系）特有的分子指紋圖譜。研究結(jié)果為‘黃山白茶’特異茶樹種質(zhì)資源的鑒定、保護(hù)和利用提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三個‘黃山白茶’品種（系）及其余43份茶樹品種（系）均來源于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)皖中試驗站的茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室的茶樹種質(zhì)資源圃（31°25′N，117°09′E），取嫩葉后用干冰速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣品名稱及產(chǎn)地來源詳見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測

選用EZgene TMCPPlant Miniprep Kit (Biomiga, USA)試劑盒提取茶樹樣品基因組DNA。利用NanoDrop 2000紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和純度，所有樣品稀釋至30～50 ng·μL-1用于PCR擴(kuò)增實驗。

首先對所有患牙進(jìn)行完善的根管治療后，再行牙周基礎(chǔ)治療，包括齦上潔治、齦下刮治及根面平整術(shù)等，必要時進(jìn)行調(diào)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測

根據(jù)先前的研究，選取了6個多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為核心標(biāo)記組，并對46份供試茶樹品種（系）進(jìn)行擴(kuò)增以構(gòu)建‘黃山白茶’特異的分子指紋圖譜。利用毛細(xì)管電泳檢測PCR產(chǎn)物結(jié)果可知，6個標(biāo)記對46份茶樹品種（系）擴(kuò)增條帶清晰、片段大小在設(shè)計片段區(qū)間內(nèi)、且均顯示出較好的多態(tài)性（可參見圖1）。

根據(jù)條帶峰圖進(jìn)行人工方法讀帶，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，并根據(jù)軟件要求轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)格式。利用POPGENE V1.32軟件計算等位基因數(shù)（, number of alleles）和主效等位基因頻率（, major allele frequency）。利用PowerMarker 3.25軟件計算引物的觀測雜合度（, Observed heterozygosity）、期望雜合度（, Expected heterozygosity）和多態(tài)性信息含量（PIC, polymorphism information content）。

表1 選取的46份茶樹品種（系）信息

表2 六個標(biāo)記的引物信息

表3 六個標(biāo)記對46份茶樹品種擴(kuò)增多態(tài)性分析

圖1 六個標(biāo)記對46份茶樣擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳圖

圖2 三個‘黃山白茶’品種（系）的分子指紋圖譜

田間初見玉米銹病病葉時，用20%三唑酮乳油900mL/hm2，或12.5%烯唑醇 (禾果利)450～600g/hm2對水噴霧防治，視病情酌情補(bǔ)治。玉米螟蟲穗率達(dá)10%或花絲有蟲50頭/百穗時，先剪去穗頂花絲，再用4.5%高效氯氰菊酯乳油750～900mL/hm2對水噴玉米穗頂。

PCR反應(yīng)體系、PCR擴(kuò)增程序、毛細(xì)管電泳檢測及條帶分析參考相關(guān)文獻(xiàn)[8,12]。

1.2.4數(shù)據(jù)整理與分析

“一帶一路”項目建設(shè)中，金融發(fā)揮著十分重要的作用，金融不僅能夠?qū)崿F(xiàn)資源配置的優(yōu)化，還可發(fā)揮杠桿作用，合理調(diào)節(jié)市場經(jīng)濟(jì)，在短期內(nèi)快速聚集資金，為相關(guān)行業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。但是，我國金融支持與合作還面臨著很多的風(fēng)險，這些均會影響金融支持與合作，使得金融行業(yè)內(nèi)的不穩(wěn)定因素增加，為“一帶一路”項目建設(shè)金融支持與合作帶來較大的風(fēng)險與挑戰(zhàn)。

從本課題組先前開發(fā)的SSR標(biāo)記中選取6對SSR引物[8]，序列由上海通用生物有限公司合成，引物序列及退火溫度詳見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛細(xì)管電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物

1.2.2引物選擇與合成

2.2 標(biāo)記多態(tài)性分析

對檢測的6個標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析（可參見表3）。結(jié)果顯示，共檢測到26個等位位點數(shù)，平均為4.33個；主效等位基因頻率值在0.283（CsL68）至0.370（CsL76）之間，平均為0.335；觀測雜合度從最低的0.143（CsL60）至最高的1.000（CsL67），平均為0.571；期望雜合度在0.143（CsL60）至0.813（CsL67和CsL68）之間，平均值為0.613；多態(tài)性信息含量（PIC）在0.700（CsL76）至0.786（CsL73）之間，平均為0.740。PIC值是衡量位點多態(tài)性的最重要的指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時為高度多態(tài)位點，當(dāng)0.25

2.3 ‘黃山白茶’品種（系）分子指紋圖譜構(gòu)建

毛細(xì)管電泳檢測可以清晰的顯示每個樣品擴(kuò)增條帶的大小。為了更加直觀地呈現(xiàn)結(jié)果，6個標(biāo)記CsL56、CsL60 CsL67、CsL68、CsL73和CsL76分別用A、B、C、D、E和F替代。通過標(biāo)記結(jié)合擴(kuò)增條帶大小的方式，編碼每個品種（系）的指紋圖譜。此外，分子指紋代碼結(jié)合品種（系）名稱、種質(zhì)類型、亞種分類、選育地區(qū)等信息，構(gòu)建每個品種（系）的特異分子指紋圖譜，詳見圖2。

建立參數(shù)化模型，關(guān)鍵是能明確表達(dá)模型結(jié)構(gòu)的參數(shù)變量以及它們之間的關(guān)系。壓鉚連接結(jié)構(gòu)參數(shù)變量如表1所示，壓鉚連接模型的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

從區(qū)域分布上看，內(nèi)蒙古地區(qū)“草原絲綢之路”可分為西部段和東部段兩部分。西部段以呼和浩特、烏蘭察布、包頭、鄂爾多斯為重要支點，向西經(jīng)寧夏、青海與新疆絲綢之路相連；東部段由呼倫貝爾、通遼、赤峰等重要節(jié)點城市為依托，連接著俄羅斯、蒙古國，是通往歐洲絲綢之路的重要通道。

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于茶樹進(jìn)化起源研究、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、分子指紋圖譜構(gòu)建等方面，具有重要作用[7,8]。基于DNA分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜，可以快速、準(zhǔn)確的對植物新品種（系）及雜交后代等進(jìn)行真?zhèn)舞b定，并且具有很強(qiáng)的個體特異性[10,11]。分子指紋可以進(jìn)行品種真實性的鑒別從而保護(hù)品種權(quán)所有者的合法權(quán)益，也可以鑒定已知種質(zhì)與新種質(zhì)資源的區(qū)別，便于育種工作者進(jìn)行遺傳研究[13,15]。

本研究篩選了6個多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR標(biāo)記作為一個核心標(biāo)記組，利用高通量、高分辨率的毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定，分析了6個標(biāo)記的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明，標(biāo)記平均等位基因數(shù)、平均主效等位基因數(shù)和平均多態(tài)性信息含量分別為4.33、0.335和0.740，總體上各指標(biāo)均較高。標(biāo)記多態(tài)性的核心指標(biāo)PIC值顯著高于先前的研究結(jié)果[9,16]，但與另外幾個研究結(jié)果值差別不大[11,13,14]，主要是由于這些指標(biāo)受多種因素的影響，如SSR標(biāo)記數(shù)目、SSR標(biāo)記的重復(fù)基序次數(shù)和類型、樣本數(shù)量和遺傳背景差異大小、電泳檢測方法等[8,12]。此外，利用篩選的核心標(biāo)記組成功構(gòu)建了三個‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜，為‘黃山白茶’特異種質(zhì)資源鑒定、品種保護(hù)和推廣利用奠定了堅實基礎(chǔ)。

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S571.1

A

1006-5768（2022）04-174-05

2022-08-05

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（XJDC2020015）和安徽省科技重大專項（202003a06020021）

華冰清（1992—），女，浙江省金華市人，茶學(xué)本科生，研究方向為茶樹育種學(xué)，E-mail：1106805461@qq.com。

劉升銳（1985—），男，安徽省滁州市人，副教授，研究方向為茶樹遺傳與育種研究，E-mail：liushengrui@ahau.edu.cn。

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（責(zé)任編輯：徐千懿）