耿立格，鹿秀云，郄彥敏，王新棟，孫娟，牛雪婧，王麗娜

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/ 河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050035；2. 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河北 保定 071000）

棉花黃萎病為土傳維管束病害，是世界性的重要棉花病害之一[1]。 國外報(bào)道棉花黃萎病致病菌為大麗輪枝菌Verticillium dahliae和黑白輪枝菌V.alboatrum，而我國棉花黃萎病僅由大麗輪枝菌引起[2]。 選育和利用抗病品種是控制棉花黃萎病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。

陸地棉Gossypium hirsutumL.和海島棉G.barbadenseL.是世界上廣泛栽培的2 個(gè)四倍體棉種[3]。 陸地棉豐產(chǎn)性好、適應(yīng)性廣，是棉花生產(chǎn)上主要的栽培種；海島棉纖維品質(zhì)優(yōu)良，并具有光合效率高、抗逆性強(qiáng)（耐瘠、耐旱）、高抗黃萎病、抗螨等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。 整合海島棉與陸地棉優(yōu)異基因，實(shí)現(xiàn)種間遺傳重組，創(chuàng)制出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆的棉花新種質(zhì)，一直是棉花種質(zhì)創(chuàng)新的重要研究課題。 陸地棉背景的海島棉染色體置換系是利用陸地棉單體作母本與海島棉染色體供體雜交，從雜交后代中通過鏡檢選擇，經(jīng)多代連續(xù)回交后，培育的單一海島棉染色體置換的陸地棉系[6]。其中，攜帶抗黃萎病基因的染色體也能被置換。陸地棉背景的海島棉染色體置換系，由于僅有1 對置換的海島棉同源染色體或染色體片段， 基因組與陸地棉的遺傳背景相近，可作為橋梁進(jìn)行陸地棉品種改良，進(jìn)而克服陸海雜種后代瘋狂分離等不利因素。 因此，將其與優(yōu)異陸地棉材料雜交是創(chuàng)制聚合海島棉與陸地棉優(yōu)異性狀新種質(zhì)的有效途徑和方法[7-8]。

Jenkins 等[9]利用18 個(gè)海島棉染色體置換系（受體親本為陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，供體親本為海島棉標(biāo)準(zhǔn)系3-79） 和3 個(gè)優(yōu)異陸地棉品系SG747、PSC355、FM966 進(jìn)行雜交，從F1開始，將全部花粉混合授粉（1 代隨機(jī)交配記為C0），經(jīng)過5 代隨機(jī)交配獲得隨機(jī)交配群體RMBUP （random-mated barbadense upland population）-C4。利用特異性微衛(wèi)星標(biāo)記對RMBUP-C4 群體自交1 代獲得的RMBUPC4S1 群體進(jìn)行基因型鑒定，確認(rèn)16 條不同的海島棉染色體存在此群體中， 每個(gè)植株至少包含5 個(gè)海島棉染色體置換片段。 RMBUP-C4S1 又經(jīng)過4代自交獲得RMBUP-C4S5。 該群體攜帶海島棉基因，遺傳多樣性豐富；因此，通過鑒定評價(jià)其各種性狀，可為棉花的資源研究和特色育種提供豐富的種質(zhì)，具有較強(qiáng)的利用潛力[11]。

本研究針對具有陸地棉背景擁有海島棉基因的RMBUP-C4S5 群體的148 個(gè)株系， 以強(qiáng)致病力大麗輪枝菌菌株為接種病原菌，采用溫室苗期切根接種法和田間病圃成株期鑒定法評價(jià)其黃萎病抗性，以期篩選抗、耐黃萎病的新種質(zhì)，進(jìn)而為抗黃萎病的優(yōu)異棉花種質(zhì)資源研究和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試棉花材料為RMBUP-C4S5 的148 個(gè)株系，編號為鑒1～88、鑒90～107 和鑒109～150。該群體來源于美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)局農(nóng)業(yè)遺傳和可持續(xù)農(nóng)業(yè)研究中心。

感病對照棉花品種為鄂荊1 號[12]，由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；抗病對照棉花品種為中植棉2 號[13]，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所中期庫提供。

1.2 棉花黃萎病菌

供試強(qiáng)致病力大麗輪枝菌菌株為WX-1[14]，由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省邢臺市威縣棉花病株分離并保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1苗期棉花黃萎病抗性評價(jià)方法。 （1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。 采用溫室苗期切根接種法[15]，在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3 個(gè)重復(fù)（區(qū)組），每個(gè)重復(fù)包括148 個(gè)待測株系、1 個(gè)抗病對照和1 個(gè)感病對照品種。 （2）培育棉苗。 育苗基質(zhì)為田園土與林下土混合物，二者按體積比1∶1 混勻后，經(jīng)121 ℃間歇滅菌2 次，每次1 h，間隔1 d。 將滅菌的育苗基質(zhì)裝入書式育苗盒（32 孔，深度12 cm），裝至育苗盒高度的三分之二時(shí)，澆透水。將供試棉花種子播于育苗孔中，每孔3 粒，半盒16 孔48 粒種子作為1 次重復(fù)。 出苗后定苗，每孔保留2 株健康棉苗。 在日光溫室內(nèi)培養(yǎng)，溫度為20～28 ℃，光照條件為晴天自然光照，陰天開啟補(bǔ)光燈。培育棉苗至2～3 片真葉時(shí)備用。（3）人工接種棉花黃萎病菌。 在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上活化黃萎病菌，將新活化的黃萎病菌接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)液中，25 ℃振蕩 （180 r·min－1）培養(yǎng)5 d 后用4 層紗布過濾，收集孢子，用血球計(jì)數(shù)板檢測孢子含量，并用滅菌水將孢子含量調(diào)至2×107mL－1，作為病原菌接種液，現(xiàn)配現(xiàn)用。 棉苗長至2～3 片真葉時(shí)，將育苗盒打開，在距育苗盒底部2.0 cm 處用剪刀剪斷棉根，合上育苗盒，將育苗盒浸泡在已配好的孢子懸浮液（每盒2 L）中，40 min 后取出育苗盒，把育苗盒置于溫室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。（4）棉花黃萎病調(diào)查方法。當(dāng)感病對照棉花品種鄂荊1 號發(fā)病較重時(shí)（接種后40 d），按照石磊巖等[16]溫室苗期棉花黃萎病5 級調(diào)查法，調(diào)查記載單株棉苗的發(fā)病等級，計(jì)算病情指數(shù)（病指，DI）。棉苗黃萎病分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0 級， 健康棉株；1 級，1～2片子葉發(fā)病；2 級，1 片真葉發(fā)??；3 級，2 片及以上真葉發(fā)病或病葉脫落，僅剩心葉；4 級，全株枯死。 病指計(jì)算公式如下：DI＝[∑（dc×nc）/（4×nt）]×100。式中，dc為相應(yīng)病級，nc為對應(yīng)病級病株數(shù)；nt為總株數(shù)。

1.3.2成株期棉花黃萎病抗性評價(jià)方法。 （1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。 于2020－2021 年在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所定興縣田間病圃， 對RMBUP-C4S5 群體苗期表現(xiàn)耐黃萎病的8 個(gè)棉花株系和隨機(jī)選取的8 個(gè)感病株系，依據(jù)《棉花抗病蟲性評價(jià)技術(shù)規(guī)范 第5 部分： 黃萎病》（GB/T 22101.5－2009）[17]進(jìn)行黃萎病抗性鑒定。 2020 年田間病圃鑒定材料包括3 個(gè)苗期耐黃萎病株系、4 個(gè)感病株系，2021 年田間病圃鑒定材料包括5 個(gè)苗期耐黃萎病株系、4個(gè)感病株系，2 年均種植抗病對照和感病對照品種。 試驗(yàn)采用單行區(qū)，行長5 m，行距0.70 m，定苗時(shí)每行留20 株左右。 小區(qū)隨機(jī)排列， 設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。 播種時(shí)間為4 月底。 （2）棉花黃萎病調(diào)查方法。為了篩選出抗病性強(qiáng)的株系材料，在田間棉花黃萎病發(fā)生高峰期植株發(fā)病比較嚴(yán)重時(shí)（8 月下旬）進(jìn)行病情調(diào)查， 每個(gè)重復(fù)調(diào)查單行全部棉株發(fā)病情況。 按照5 級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行棉株病情調(diào)查記錄，并計(jì)算病指，計(jì)算方法同1.3.1。 田間黃萎病病株分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0 級，健康棉株；1 級，病株顯癥葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的比例≤25%；2 級，25%＜病株顯癥葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的比例≤50%；3 級，50%＜病株顯癥葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的比例≤75%；4 級，病株顯癥葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的比例＞75%[17]。

1.4 黃萎病抗性評價(jià)指標(biāo)計(jì)算方法

采用相對病情指數(shù)（相對病指，RDI）評價(jià)各株系的抗性水平，相對病指計(jì)算公式：RDI＝DI×K。其中K＝50÷感病對照實(shí)際病指，50 為規(guī)定感病對照品種的標(biāo)準(zhǔn)病指。

溫室苗期、病圃成株期棉花抗黃萎病類型根據(jù)相對病指確定，按照全國統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[17]抗病類型劃分為免疫（I）、高抗（HR）、抗?。≧）、耐?。═）、感?。⊿）5 個(gè)級別，具體劃分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 棉花抗黃萎病類型劃分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 數(shù)據(jù)處理軟件和統(tǒng)計(jì)分析方法

利用Microsoft Excel 軟件，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和圖表繪制；利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行平均值等描述性統(tǒng)計(jì)、單因素方差分析、最小顯著差數(shù)法多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫室苗期黃萎病抗性鑒定結(jié)果

2.1.1RMBUP-C4S5 株系的黃萎病相對病指分布。 溫室黃萎病抗性鑒定結(jié)果顯示：感病對照鄂荊1 號病指為49.6，相對病指為50.0；抗病對照中植棉2 號病指為33.8，相對病指為34.1，抗病對照表現(xiàn)為耐黃萎病。 對148 個(gè)RMBUP-C4S5 株系的黃萎病相對病指進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明各株系黃萎病相對病指為30.0～89.1， 平均相對病指為52.9。其中：8 個(gè)株系對黃萎病表現(xiàn)為耐病， 相對病指低于抗病對照，占群體鑒定株系的5.4%；相對病指高于抗病對照低于感病對照的株系有57 個(gè)， 占鑒定株系的38.5%；相對病指高于感病對照的株系有83個(gè)，占鑒定株系的56.1%。

2.1.2RMBUP-C4S5 株系的黃萎病抗性差異分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，供試的148 個(gè)RMBUP-C4S5 株系苗期黃萎病相對病指變異系數(shù)為23.62%， 群體株系間相對病指存在極顯著差異（表2）。 表明各供試株系對黃萎病的抗性具有較大的差異，可以從中篩選出對黃萎病抗性較好的株系。

表2 供試棉花RMBUP-C4S5株系間苗期黃萎病相對病指方差分析結(jié)果

2.1.3不同供試RMBUP-C4S5 株系的苗期黃萎病抗性水平。 供試的148 個(gè)RMBUP-C4S5 棉花株系中沒有免疫、高抗、抗黃萎病的棉花材料?？共φ掌贩N中植棉2 號表現(xiàn)為耐黃萎病。供試棉花株系中相對病指高于35.0 的有140 個(gè)，表現(xiàn)為感病，占供試棉花株系的94.6%。 相對病指在20.0～35.0 的有8 個(gè)，即鑒32、鑒49、鑒59、鑒62、鑒78、鑒83、鑒84、 鑒85， 表現(xiàn)為耐黃萎病， 占供試棉花株系的5.4%，這8 個(gè)耐病株系的相對病指均低于抗病對照品種中植棉2 號（圖1）。 而且統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，8個(gè)耐病株系和抗病對照中植棉2 號的相對病指差異不顯著，說明苗期耐病的8 個(gè)株系對黃萎病的抗性和中植棉2 號相當(dāng)。

圖1 RMBUP-C4S5 苗期耐黃萎病株系和對照中植棉2 號相對病指的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.2 田間病圃成株期黃萎病抗性鑒定結(jié)果

RMBUP-C4S5 群體苗期耐黃萎病的8 個(gè)株系、感病的8 個(gè)株系田間病圃成株期黃萎病抗性評價(jià)中，2020 年、2021 年感病對照鄂荊1 號病情指數(shù)分別為60.5、74.3， 抗病對照中植棉2 號病情指數(shù)分別為27.0、25.3。 2020 年、2021 年抗病對照中植棉2 號相對病指分別為22.3、17.0，2020 年表現(xiàn)為耐黃萎病，2021 年表現(xiàn)為抗黃萎病。 鑒定結(jié)果（表3）表明：8 個(gè)苗期耐病的株系中，鑒78、鑒85 成株期相對病指分別為14.3、13.0，均表現(xiàn)為抗黃萎病，鑒49、鑒83 仍表現(xiàn)為耐黃萎病，而鑒32、鑒59、鑒62、鑒84 則表現(xiàn)為感黃萎?。还┰嚨? 個(gè)苗期感病的株系中，鑒19、鑒124、鑒143 在成株期表現(xiàn)為耐黃萎病，鑒13、鑒33、鑒37、鑒44、鑒140 仍表現(xiàn)為感黃萎病。 鑒78、鑒85、鑒49、鑒83 這4 個(gè)株系在苗期均表現(xiàn)為耐黃萎病，在成株期表現(xiàn)為抗或耐黃萎病，將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)遺傳材料。

表3 16個(gè)供試RMBUP-C4S5株系苗期和成株期的黃萎病相對病指和抗病類型

3 討論與結(jié)論

本研究供試材料RMBUP 群體，是利用海島棉染色體置換系創(chuàng)制的具有陸地棉背景攜帶有眾多海島棉基因、遺傳多樣性豐富的遺傳群體。 任立華等[18]、Saha 等[19-21]、Wu 等[22]、欒 明寶 等[23-24]曾對創(chuàng) 制RMBUP 群體所使用的海島棉染色體置換系開展農(nóng)藝性狀和遺傳效應(yīng)評價(jià)，Wu 等[25-26]研究了13 個(gè)染色體置換系種子的蛋白質(zhì)含量和含油量， 錢能[27]、付央等[28]進(jìn)行了一些農(nóng)藝性狀定位，McCarty 等[11]對隨機(jī)交配不同世代的RMBUP 群體進(jìn)行了農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)性狀的評價(jià)。以上主要開展的是農(nóng)藝性狀相關(guān)的研究，沒有進(jìn)行黃萎病抗性分析。 本研究對以海島棉染色體置換系創(chuàng)制的隨機(jī)交配群體RMBUP-C4S5 開展了黃萎病抗性鑒定， 篩選優(yōu)異的抗、耐黃萎病材料，對利用海島棉優(yōu)異抗病基因進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良具有重要意義。

國家棉花品種區(qū)域試驗(yàn)中黃萎病抗性鑒定采用人工成株期病圃鑒定方法[17]，對于批量棉花種質(zhì)資源進(jìn)行黃萎病抗性鑒定一般結(jié)合苗期人工接種黃萎病菌的方法進(jìn)行[29-30]。中植棉2 號是2006 年國家審定的抗黃萎病品種。在本研究人工病圃成株期鑒定中，2020、2021 年中植棉2 號黃萎病病指分別為27.0、25.3， 相對病指分別為22.3、17.0， 表現(xiàn)為耐、抗黃萎?。幻缙谇懈臃N法鑒定中，中植棉2 號病情指數(shù)為33.8，相對病指為34.1，均高于人工病圃鑒定的相對病指。本研究供試的148 個(gè)RMBUPC4S5 群體株系中，苗期沒有篩選出免疫和高抗、抗黃萎病的材料， 但苗期表現(xiàn)耐黃萎病的鑒78、鑒85，經(jīng)成株期病圃鑒定為抗黃萎病類型。 推測其主要原因是苗期采用切根接種法鑒定，會造成棉花材料根部喪失抗侵入功能，選擇壓較大，發(fā)病較重。在已有的研究報(bào)道中也出現(xiàn)過類似的結(jié)果[31]。對成株期鑒定出的RMBUP-C4S5 群體抗黃萎病材料， 已經(jīng)開展基因組研究，以期進(jìn)一步確認(rèn)此抗性是否來自于海島棉。

大田生產(chǎn)中棉花常常在現(xiàn)蕾期出現(xiàn)黃萎病典型癥狀，一般在七八月份出現(xiàn)發(fā)病高峰。但近年來，棉花黃萎病發(fā)病時(shí)間明顯提前，在5 月底或6 月初田間出現(xiàn)零星病株，較以往提前7 d 左右[32]。 因此，苗期棉花黃萎病抗性鑒定對于優(yōu)異抗病種質(zhì)資源篩選也尤為必要。

本研究通過對RMBUP-C4S5 的148 個(gè)株系進(jìn)行黃萎病抗性鑒定，明確了群體各株系的苗期黃萎病抗性水平，篩選出4 個(gè)苗期耐黃萎病、成株期抗或耐黃萎病的株系鑒78、鑒85、鑒49、鑒83，有望成為棉花抗黃萎病種質(zhì)資源研究和品種改良利用新的優(yōu)異種質(zhì)資源。