史曉偉，王東峰，鄧曉豐，于文靜，趙 穎，史術(shù)峰

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一種嚴重影響老年人的慢性骨關(guān)節(jié)退行性疾病，最常見的臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛及功能活動障礙等，但根本的病因是膝關(guān)節(jié)軟骨退變破壞并進行性加重[1]。導(dǎo)致KOA發(fā)病的高危因素眾多，包括性別、年齡、肥胖和關(guān)節(jié)過度使用等，這其中膝關(guān)節(jié)承受的異常生物力在發(fā)揮著重要作用[2]，F(xiàn)elson DT教授認為骨關(guān)節(jié)炎可以定義為一種生物力學(xué)疾病[3]，重點突出了生物力學(xué)異常相關(guān)因素在KOA發(fā)病的關(guān)鍵作用。在膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定中，膝周肌肉組織發(fā)揮動力性作用，肌肉結(jié)構(gòu)功能異常會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨生物力學(xué)環(huán)境改變從而導(dǎo)致KOA發(fā)生，研究證實膝周肌肉無力加速KOA的發(fā)病與進展[4]。因此，通過干預(yù)肌肉軟組織進而間接糾正關(guān)節(jié)軟骨生物力學(xué)環(huán)境，從而延緩KOA軟骨病變是一種良好的治療策略。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)針刀、電針具有改善早期KOA兔股直肌、股二頭肌萎縮的作用，那么其對膝關(guān)節(jié)軟骨是否發(fā)揮保護作用？針刀、電針對改善早期KOA兔模型關(guān)節(jié)軟骨損傷哪個治療效果更佳？基于以上疑問，本研究探索針刀、電針對早期KOA兔模型膝關(guān)節(jié)軟骨細胞結(jié)構(gòu)及Ⅱ型膠原的表達情況，為針刀、電針治療KOA提供動物實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只健康清潔級新西蘭雄兔(6月齡，體質(zhì)量2.5～3.0 kg)，購買并飼養(yǎng)于北京金牧陽實驗動物有限公司(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 2015-0005；動物使用許可證號：SYXK 2015-0008)，所有實驗動物單籠飼養(yǎng)[溫度(22±2)℃，相對濕度(45±5)%]，并自由獲取食物和水。本實驗研究獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準，實驗過程嚴格按照實驗動物管理規(guī)定進行。

1.2 主要試劑及儀器

樹脂繃帶(100 mm ×1 800 mm，泰洲牌，揭西縣泰洲醫(yī)療有限公司)；高分子固定繃帶(KCP04，可耐特牌,蘇州可耐特醫(yī)療科技有限公司)；一次性針刀(0.35 mm×25 mm，喜灸牌,德邦醫(yī)療有限公司)；一次性使用針灸針(0.2 mm×13 mm，環(huán)球牌,蘇州針灸醫(yī)療用品有限公司)；電針治療儀(SDZ-Ⅱ，華佗牌,蘇州醫(yī)療用品有限公司)；塞來昔布(批號：國藥準字J20120063；西樂葆，0.2 g/片，輝瑞制藥有限公司)；兔CTX-2ELISA試劑盒(60456RA,北京瑞格博科技有限公司)；山羊抗兔Type Ⅱ一抗(1320-01,美國SouthernBiotech有限公司)；小鼠抗兔 F-actin一抗(ab205,美國Abcam公司)；CY3-驢抗山羊二抗(A0502,北京碧云天科技有限公司)；488-山羊抗小鼠二抗(A0428,北京碧云天科技有限公司)；全自動酶標儀(Varioskan Flash，美國Thermo公司)；激光共聚焦顯微鏡(FV3000,日本奧林巴斯有限公司)。

1.3 KOA兔模型制備

KOA兔模型制備的原理為下肢過伸位固定制動法(改良Videman法)，具體造模方法參照本團隊前期研究[5-6]，簡要步驟包括：①兔左后肢伸直，醫(yī)用膠帶貼緊兔毛完全纏繞左后肢；②泡沫雙面膠(0.5 cm厚；上海得力文具有限公司)覆蓋醫(yī)用膠帶(范圍從腹股溝至膝蓋)；③樹脂繃帶沿泡沫雙面膠范圍纏繞1圈；④高分子固定繃帶纏繞樹脂繃帶1周；⑤樹脂繃帶再次纏繞1圈、同時醫(yī)用膠帶固定,最后形成一個類似“石膏”樣的制動裝置。連續(xù)制動4周。

1.4 動物實驗分組及干預(yù)方法

新西蘭兔(30只)根據(jù)體質(zhì)量，隨機數(shù)字表法分為空白組(6只)和造模組(24只)，空白組正常飼養(yǎng)，KOA造模組進行動物模型制備。KOA兔制動4周后，拆除固定裝置，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，根據(jù)Lequesne MG評分[7]再隨機分為模型組、針刀組、電針組和西藥組(每組6只)。各組干預(yù)治療方案：

1.4.1 空白組和模型組 正常抓取，同時進行純水3 mL灌胃，1次/d。

1.4.2 針刀組 每日純水3 mL灌胃，同時進行針刀干預(yù)(每周2次)，針刀進針點：股內(nèi)、外側(cè)肌腱止點、股直肌腱止點、股二頭肌腱止點、鵝足腱囊以及局部壓痛反應(yīng)點、結(jié)節(jié)點；進針方法：針刀刀體與皮膚切面垂直、與肌纖維走行平行刺入，每次1～2刀，出刀后加壓止血。

1.4.3 電針組 8個常用穴位分別為：血海、梁丘、內(nèi)膝眼、犢鼻、陰陵泉、陽陵泉、委中及曲泉(取穴參照《實驗針灸學(xué)》)，一次性無菌針灸針刺入(深度10 mm)，電極依次連接委中-梁丘組和血海-曲泉組(疏密波，頻率2/100 Hz，強度2 mA)進行電刺激，每次20 min，隔天1次。

1.4.4 西藥組 進行塞來昔布灌胃治療(溶于純水，劑量為10 mg/kg)，1次/d。各組均干預(yù)治療4周。

1.5 兔血清、膝關(guān)節(jié)液CTX-2含量的檢測

新西蘭兔進行耳緣靜脈取血，低溫冷凍離心機4 ℃ 15 000 rpm離心20 min后，取上清液即為兔血清。應(yīng)用空氣栓塞法處死兔子，將兔膝關(guān)節(jié)腔切開一小口，用0.9%氯化鈉溶液(2 mL)反復(fù)沖洗關(guān)節(jié)腔獲得關(guān)節(jié)腔液。兔血清、關(guān)節(jié)液Ⅱ型膠原C端肽(CTX-2)含量應(yīng)用ELISA試劑盒進行檢測，操作嚴格按照說明書進行(60456RA，北京瑞格博)。首先根據(jù)標準品濃度計算標準曲線，計算各組樣品CTX-2含量并統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 膝關(guān)節(jié)軟骨免疫熒光雙標染色

兔膝關(guān)節(jié)置于冰臺上，迅速分離股骨、脛骨，剪骨刀快速切取軟骨組織(股骨內(nèi)側(cè)髁)，4%多聚甲醛固定72 h，充分浸入15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4周。預(yù)處理完成的軟骨組織常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋并切片備用(4 μm厚度)。

免疫熒光雙標染色簡要步驟：①軟骨玻片在烤片機上65 ℃烤片1 h;②常規(guī)進行脫蠟、水化;③切片浸入EDTA修復(fù)液(pH 6.0)進行抗原修復(fù)15 min(微波爐法);④3 %雙氧水室溫浸泡30 min;⑤PBS液沖洗玻片，滴牛血清白蛋白(A8020；北京索萊寶)室溫孵育2 h;⑥滴加山羊抗兔Type Ⅱ一抗(1∶100)和小鼠抗兔F-actin一抗(1∶100)4 ℃冰箱過夜;⑦PBS液沖洗，滴加熒光二抗：CY3-驢抗山羊(1∶100)和488-山羊抗小鼠(1∶100)37 ℃避光孵育1 h;⑧DAPI染核10 min(避光);⑨防淬滅水溶性封片劑(S2100；北京索萊寶)封片，4 ℃冰箱保存。染色完成的熒光切片在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察并拍片，使用Image-Pro Plus軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組兔膝關(guān)節(jié)液、血清CTX-2含量比較

與空白組比較，模型組關(guān)節(jié)液CTX-2含量表達升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后，與模型組比較，針刀可降低關(guān)節(jié)液CTX-2表達，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，電針明顯降低關(guān)節(jié)液CTX-2表達(P<0.05)，西藥顯著降低關(guān)節(jié)液CTX-2表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

與空白組比較，模型組血清CTX-2含量表達顯著升高(P0.01)；干預(yù)后，與模型組比較，針刀、電針可降低血清CTX-2表達，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，西藥可明顯降低血清CTX-2表達(P<0.05)；針刀與電針治療在調(diào)節(jié)血清CTX-2方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組兔血清、膝關(guān)節(jié)液CTX-2含量比較

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨免疫熒光染色結(jié)果比較

典型兔股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨免疫熒光雙標染色可知，細胞核染成藍色(DAPI)，F(xiàn)-actin細胞骨架蛋白染成綠色，Ⅱ型膠原蛋白染成紅色。各指標的統(tǒng)計分析以固定視野內(nèi)累計光密度(IOD)指標進行量化。見圖1。

在細胞核層面可知，與空白組比較，模型組細胞核IOD與空白組比較明顯降低(P<0.05)；干預(yù)治療后，與模型組比較，針刀組與電針組細胞核IOD表達升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，西藥組細胞核IOD表達顯著升高(P<0.01)。

在F-actin骨架蛋白層面，與空白組比較，模型組F-actin骨架蛋白IOD顯著降低(P<0.01)；干預(yù)后，與模型組比較，針刀組和電針組F-actin骨架蛋白IOD表達升高差異無統(tǒng)計學(xué)意義，西藥組骨架蛋白IOD表達明顯升高(P<0.05)。

在Ⅱ型膠原蛋白層面，與空白組比較，模型組Ⅱ型膠原蛋白IOD顯著降低(P<0.01)；干預(yù)后，與模型組比較，針刀組和電針組Ⅱ型膠原IOD表達量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，西藥組Ⅱ型膠原IOD表達量明顯升高(P<0.05)；針刀組調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原表達與電針組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞核、F-actin骨架蛋白和Ⅱ型膠原表達比較

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)屬于中醫(yī)“痹證”范疇，其核心病理機制是關(guān)節(jié)軟骨的退變及進行性加重，典型臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛及關(guān)節(jié)活動功能障礙[8]。隨著研究的深入，國際上對KOA的認識不斷更新，其中膝關(guān)節(jié)生物力學(xué)異常因素逐漸得到重視，有研究者重新定義KOA為炎癥和生物力學(xué)因素共同作用導(dǎo)致的一種全關(guān)節(jié)疾病，病變的組織包括滑膜、軟骨、關(guān)節(jié)周圍的韌帶肌肉及軟骨下骨等[9]。這種KOA的新定義，除外廣泛認可的炎癥因素[10]，突出強調(diào)了膝關(guān)節(jié)異常生物力學(xué)的關(guān)鍵作用。美國D.T.Felson教授甚至認為骨關(guān)節(jié)炎就是一種生物力學(xué)疾病[3]。在認識到生物力學(xué)因素在KOA致病中的關(guān)鍵作用后，研究者試圖通過改善膝關(guān)節(jié)周圍生物力學(xué)環(huán)境來治療KOA，常見的方法包括減重(減輕膝關(guān)節(jié)的機械負荷[11])、楔形鞋墊的應(yīng)用(改善膝關(guān)節(jié)生物力線[12])、輔助支具(減輕膝關(guān)節(jié)壓力負荷[13])以及康復(fù)鍛煉(改善膝周肌肉功能[14])。既往研究證實KOA患者存在股四頭肌萎縮的現(xiàn)象[15]，同時肌肉無力與KOA癥狀加重密切相關(guān)[4]；細胞實驗證實了適度的壓力負荷會促進軟骨細胞及細胞外基質(zhì)的合成代謝[16]。因此通過改善KOA膝周肌肉功能，間接改善關(guān)節(jié)軟骨力學(xué)環(huán)境，從而延緩軟骨破壞退變是一種可行的治療策略。

我們團隊前期研究證實了制動4周KOA兔股直肌、股二頭肌存在肌肉萎縮現(xiàn)象，通過針刀、電針干預(yù)后可明顯改善肌肉萎縮狀態(tài)，那么針刀、電針對肌肉結(jié)構(gòu)功能的改善能否對膝關(guān)節(jié)軟骨發(fā)揮保護作用？本研究應(yīng)用免疫熒光雙標染色，對關(guān)節(jié)軟骨組織的細胞核、細胞膜骨架蛋白和Ⅱ型膠原蛋白等結(jié)構(gòu)在激光共聚焦顯微鏡下的區(qū)分顯色。關(guān)節(jié)軟骨組織大致分為兩部分，軟骨細胞及包繞軟骨細胞發(fā)揮保護作用的細胞外基質(zhì)(ECM)，軟骨細胞合成分泌構(gòu)成ECM結(jié)構(gòu)的蛋白分子等，ECM結(jié)構(gòu)為軟骨細胞提供合適的空間結(jié)構(gòu)。關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生磨損病變后，對軟骨細胞和細胞外基質(zhì)的表達均會產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定視野內(nèi)模型組細胞核IOD與空白組比較顯著減少(P<0.05)，同時模型組細胞膜骨架蛋白F-actin IOD與空白組比較也顯著減少(P<0.05)，筆者定量觀測的AOI是從軟骨淺表層開始往下的目標區(qū)域，提示與空白組比較，模型組固定視野內(nèi)軟骨細胞顯著減少；干預(yù)治療后，針刀組和電針組細胞核和F-actin骨架蛋白IOD表達有一定程度升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而西藥組細胞核和F-actin骨架蛋白IOD表達與模型組比較顯著升高，提示針刀、電針對固定視野內(nèi)軟骨細胞有一定保護作用，但西藥組效果更佳。軟骨ECM主要由水、膠原和蛋白多糖等構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中Ⅱ型膠原蛋白在維持關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]，既往研究已證實軟骨細胞合成分泌的膠原中90 %以上為Ⅱ型膠原[18]，因此Ⅱ型膠原的含量可間接反映ECM功能狀態(tài)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，軟骨切片在固定視野內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白IOD與空白組相比顯著減少，與其他研究者結(jié)果一致[19]，提示關(guān)節(jié)軟骨ECM存在破壞降解增多；干預(yù)治療后，針刀、電針Ⅱ型膠原蛋白IOD與模型組比較表達有升高趨勢(P>0.05)，但西藥組Ⅱ型膠原蛋白IOD表達更高(P<0.05)，提示針刀、電針對早期KOA兔關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原具有一定保護作用，但效果不及西藥。

CTX-2是Ⅱ型膠原蛋白剪切體的羧基末端肽,軟骨分解代謝后可進入血液和關(guān)節(jié)液等體液組織中，既往研究證實CTX-2含量濃度與Ⅱ型膠原蛋白損傷程度呈正相關(guān)[20]。筆者應(yīng)用ELISA法對兔血清及膝關(guān)節(jié)液CTX-2含量進一步進行探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組血清及關(guān)節(jié)液CTX-2含量與空白組比較表達升高，提示模型組關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原降解增多；干預(yù)治療后，針刀、電針血清及關(guān)節(jié)液CTX-2含量表達降低(其中電針關(guān)節(jié)液P<0.05),而西藥組血清及關(guān)節(jié)液CTX-2含量表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)，提示西藥組緩解關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原降解作用最佳，針刀、電針具有一定程度的保護作用。本結(jié)果與免疫熒光Ⅱ型膠原的表達相一致。

從理論假說來講，既然針刀、電針具有改善早期KOA肌肉萎縮的作用，那么肌肉結(jié)構(gòu)的改善其作用于膝關(guān)節(jié)的生物力必然引起改變，關(guān)節(jié)的異常生物力學(xué)環(huán)境發(fā)生改變進而對軟骨發(fā)揮保護作用，延緩關(guān)節(jié)軟骨細胞死亡及細胞外基質(zhì)的降解。但本研究結(jié)果僅證實了針刀、電針對關(guān)節(jié)軟骨具有一定的保護緩解作用，而關(guān)節(jié)軟骨保護最佳的是西藥塞來昔布。既往研究已經(jīng)證實針刀[21]、電針[22]對減輕KOA患者疼痛、改善關(guān)節(jié)功能活動的有效性，針刀、針刺干預(yù)KOA也被膝骨關(guān)節(jié)炎階梯治療專家共識(2018年版)[23]以及膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(2015年版)[24]所推薦。針刀干預(yù)的定點主要在肌肉肌腱的起止點及敏感壓痛點，可能主要發(fā)揮止痛、松解粘連和調(diào)節(jié)本體感受器等[5]，而電針具有復(fù)雜的鎮(zhèn)痛機制[25]，同時還有研究者發(fā)現(xiàn)電針具有一定的抗炎作用(調(diào)節(jié)NF-κB通路[26])，理論上講電針可能比針刀緩解關(guān)節(jié)軟骨降解更佳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刀、電針在關(guān)節(jié)軟骨保護方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究證實的塞來昔布具有最佳的關(guān)節(jié)軟骨保護作用，塞來昔布是選擇性非甾體消炎藥的代表，通過抑制COX、降低前列腺素(PG)合成，從而降低外周神經(jīng)敏化或疼痛強度，達到鎮(zhèn)痛作用[27]，是國內(nèi)外眾多膝骨關(guān)節(jié)炎指南推薦的一線用藥。塞來昔布發(fā)揮軟骨保護作用可能的機制是：①緩解疼痛，改善下肢運動，從而緩解肌肉萎縮狀態(tài)；②研究證實塞來昔布可減少“炎癥風(fēng)暴”炎癥因子的釋放而發(fā)揮強大抗炎作用[28]，事實上炎癥因素也是KOA發(fā)病中另一個非常重要的環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)針刀、電針對膝關(guān)節(jié)軟骨有一定的保護作用，增加樣本量或者延長干預(yù)治療時間對其緩解軟骨降解的作用是否更顯著？針刀、電針聯(lián)合塞來昔布治療KOA，其膝關(guān)節(jié)軟骨保護作用是否更佳？這些假設(shè)需要進一步研究證實。

綜上，針刀、電針對早期KOA兔模型膝關(guān)節(jié)軟骨細胞及Ⅱ型膠原蛋白代謝具有一定保護作用，但效果不如塞來昔布。