丁秋燕，汪 偉，羅昊軍，李 怡，丁涵露

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610072 ；2.四川省自貢市第四人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 自貢 643000)

目前抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis，AAV)的病死率仍然較高，血清中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)抗體和蛋白酶3(proteinase 3，PR3)抗體是抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)的主要類型[1]。AAV腎損傷病理類型分為局灶性、新月體性、混合性和硬化性[2]，不同腎組織病理損傷的發(fā)生機(jī)制不清楚。我國原發(fā)性AAV中多血管炎(MPA)最常見，約占80%[1]。髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cell，mDC)通過調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)等細(xì)胞的功能參與AAV的發(fā)病[3,4]，目前把Lin1-HLA-DR+CD11c+細(xì)胞定義為mDC，以CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞代表Treg細(xì)胞[5]，有報道AAV患者外周血DC表達(dá)下降[6]，但MPA患者外周血mDC、Treg細(xì)胞表達(dá)變化及其與伯明翰血管炎活動性評分(BVAS)、腎組織病理類型之間的關(guān)系不清楚。故本文擬對比觀察活動期、緩解期MPA患者外周血mDC、Treg 細(xì)胞水平及其與BVAS評分、腎組織病理類型之間的關(guān)系，以期為MPA的發(fā)病機(jī)制和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年4月四川省人民醫(yī)院確診的45例MPA患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2012年Chapel Hill共識會議制定的《顯微鏡下多血管炎診斷及治療指南》關(guān)于MPA的定義[7]；②初次診斷為原發(fā)性MPA、沒有進(jìn)行糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療；③血清P-ANCA抗體和MPO抗體均陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并PR3-ACNA陽性及其他繼發(fā)性腎病的患者。男23例，女22例，年齡15～71歲[(45±26)歲]。選擇同期健康志愿者15例，男8例，女7例，年齡24～68歲[(57±15)歲]。本研究獲得我院倫理委員會審查批準(zhǔn)(編號：2020393)，患者簽署臨床標(biāo)本收集檢測知情同意書?；颊叩腂VAS評分按照文獻(xiàn)計分，總分63分，15分以上為活躍，小于15分為緩解[8]?；钴S組27例，緩解組18例。MPA患者中24例行腎穿刺病理檢查，以WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行MPA患者的病理診斷[2]，其中局灶性12例，新月體性5例，混合性7例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料CD4 APC-Cy7(557871)、CD25-BB700(566447)、CD127 PE-Cy7(560822)、Lineage cocktail 1 (lin 1,由CD3, CD14, CD16, CD19,CD20, CD56系列抗原混合單克隆抗體組成)(340546)、CD11C PE-Cy7(561356)、HLA-DR APC(560896)、IgG1 APC-Cy7(557873)、IgG1 BB700(566404)、IgG1 PE-Cy7(557872)、IgG2a APC(555576)，以上試劑來自BD公司。流式細(xì)胞儀為BD FACS CantoTM II。

1.3 外周血mDC細(xì)胞和CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞檢測外周血中mDC/Treg數(shù)量檢測采用全血單抗直接標(biāo)記-溶血法；4.5 ml紅細(xì)胞裂解液加至1.5 ml肝素抗凝全血，離心后向細(xì)胞沉淀中加入3 ml紅細(xì)胞裂解液，PBS重懸細(xì)胞至200 μl,混勻后將細(xì)胞液移到試管，再以無菌PBS重懸至200 μl，取其中100 μl沉淀細(xì)胞加入Lin1-FITC抗體 4 μl、HLA-DR-APC抗體4 μl、CD11c-PE-cy7抗體2 μl，取上述另外100 ul沉淀細(xì)胞加入CD4-APC-Cy7抗體2 μl、CD25-BB700抗體5 μl，CD127-PE-Cy7抗體5 μl混勻，上述細(xì)胞和抗體的混勻液分別避光冰浴30分鐘后加入無菌PBS 洗滌、離心、去上清液，然后每管細(xì)胞液用500 μl PBS重懸細(xì)胞,以 BD FACS CantoTM II流式細(xì)胞儀對上述細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測。應(yīng)用前向散射角與側(cè)向散射角進(jìn)行設(shè)門去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片排除碎片干擾。以側(cè)向散射角和Lin1設(shè)門選擇Lin1陰性細(xì)胞,分析mDC占外周血淋巴細(xì)胞的百分比，mDC細(xì)胞以Lin1-HLA-DR+CD11c+DC占外周血淋巴細(xì)胞的比例表示；以側(cè)向散射角和CD4設(shè)門選擇CD4陽性細(xì)胞，分析CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比，Treg細(xì)胞以CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占CD4+淋巴細(xì)胞的比例表示。分別加入同型鼠單抗IgG1-APC-Cy7/IgG1- BB700/IgG1-PE-cy7，IgG2a-APC/IgG1PE-cy7作為陰性對照。上述結(jié)果分析均應(yīng)用Diva軟件。mDC細(xì)胞和Treg細(xì)胞設(shè)門見圖1，圖2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活躍組與緩解組臨床資料比較活躍組與緩解組白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血壓和血白蛋白等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，活躍組血肌酐和血MPO抗體滴度較緩解組更高，血紅蛋白較緩解組更低(P<0.05)，見表1。

圖1 MPA患者外周血mDC占外周血淋巴細(xì)胞的比例 a：淋巴細(xì)胞在外周血中的百分比；b：Lin1陰性細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的百分比；c：HLA-DR和CD11c雙陽性的細(xì)胞在Lin1陰性細(xì)胞中的百分比

表1 活躍期組與緩解期組臨床資料比較

2.2 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞表達(dá)量及其與BVAS評分關(guān)系與緩解組及健康對照組比較，活躍組mDC占外周血淋巴細(xì)胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞的百分比均下降(P<0.05)，緩解組及健康對照組上述細(xì)胞表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。mDC占外周血淋巴細(xì)胞的百分比、外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比與BVAS評分均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.64、-0.71，P<0.05)。

表2 MPA患者外周血mDC占比、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占比表達(dá)水平比較 (%)

2.3 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞與腎組織病理類型的關(guān)系新月體性組與局灶性組、混合性組比較，BVAS評分明顯升高，mDC占外周血淋巴細(xì)胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞的百分比均下降(P<0.05)；局灶性組與混合性組比較，外周血mDC與CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞、BVAS評分比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)活躍組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與緩解組無差異，但血肌酐和血MPO抗體滴度較緩解組更高而血色素更低，由于活躍組外周血mDC占淋巴細(xì)胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比均較緩解組下降，且mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞數(shù)均與BVAS評分負(fù)相關(guān)，提示mDC和Treg細(xì)胞參與了MPA發(fā)病。

按照來源可把樹突狀細(xì)胞分為髓樣DC(mDC)和淋巴樣DC(pDC)，mDC主要位于外周血、腎、胃腸、皮膚黏膜、脾臟以及淋巴結(jié)等部位，研究發(fā)現(xiàn)AAV緩解期和急性期外周血mDC和pDC均是表達(dá)下降的[6]，CD11c主要表達(dá)在mDC上[9]，故本文以CD11c標(biāo)記mDC細(xì)胞檢測外周血mDC細(xì)胞表達(dá)。本文發(fā)現(xiàn)，與緩解組及健康對照組比較，MPA活躍組患者外周血mDC占淋巴細(xì)胞的百分比均下降，且其表達(dá)量與患者BVAS評分負(fù)相關(guān)。緩解組和健康對照組的mDC占淋巴細(xì)胞百分比相比無差異。外周血mDC表達(dá)量下降可能與骨髓祖細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞減少有關(guān)，也可能與mDC促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞增多而分化為Treg細(xì)胞減少，導(dǎo)致腎組織炎癥介質(zhì)表達(dá)失衡，mDC從血液中轉(zhuǎn)移到腎臟中有關(guān)，文獻(xiàn)報道遷移至腎組織的DC攝取抗原后在腎組織局部或經(jīng)5過淋巴、血液移行到淋巴組織富含T細(xì)胞的區(qū)域并提呈相應(yīng)抗原給T細(xì)胞、活化致病T細(xì)胞而加重體內(nèi)炎癥損傷[9～11]，可見DC在AAV發(fā)病中具有重要作用。

核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(Foxp3)具有調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生長、發(fā)育的作用，因此目前把Foxp3作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)記物。然而由于Foxp3表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)，需要經(jīng)過固定、破膜等一系列步驟后方可對其進(jìn)行染色、檢測，這在很大程度上有可能對結(jié)果的重復(fù)性、準(zhǔn)確性造成干擾，所以用 CD4、CD25和 Foxp3聯(lián)合標(biāo)記調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的可行性較差。有文獻(xiàn)報道CD127在非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞高表達(dá)而在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面是低表達(dá)的，通過CD4+CD25highCD127lowTreg選定的細(xì)胞與表達(dá)FOXP3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量相近，并且CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞的特性與CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞是一致的[5]，因此本文用CD127聯(lián)合CD4、CD25檢測Treg細(xì)胞, 具有代表CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)水平的作用，同時可以保持細(xì)胞的完整性和結(jié)果的可重復(fù)性。CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞是抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)、維持自身免疫耐受的重要細(xì)胞,CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞細(xì)胞通過抑制炎癥因子的釋放減少中性粒細(xì)胞的活化并減輕效應(yīng)記憶T細(xì)胞對血管壁的破壞[12]。有研究發(fā)現(xiàn)相對于健康者，AAV患者CD4+CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞雖然數(shù)量是增加的，但其抑制炎癥反應(yīng)的功能下降[13]，有研究發(fā)現(xiàn)，AAV患者外周血活性Treg細(xì)胞表達(dá)下降[11]，本文發(fā)現(xiàn)，與緩解組及健康對照組比較，活躍組外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比下降，且其表達(dá)量與患者BVAS評分負(fù)相關(guān)，推測下降的CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞不能抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而加重血管炎的活躍度。

AAV患者的腎損傷臨床表現(xiàn)輕重不一、腎病進(jìn)展也有快有慢，其臨床表現(xiàn)的多樣性可能與其病理損傷類型的多樣化有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)病理損傷類型有助于指導(dǎo)臨床治療并預(yù)測腎臟結(jié)局[2]。腎功能最好的是局灶性病變，最差的是硬化性病變[14]，但MPA不同病理類型的發(fā)生發(fā)展機(jī)制不清楚。本文入選的MPA患者有53.3%的患者行腎穿刺病理檢查，50%的腎穿刺患者表現(xiàn)為局灶性，新月體性和混合性的占比分別為20.8%和29.2%，局灶性和混合性組的患者BVAS評分相對于新月體性組均有下降，與此相對應(yīng)的是，新月體性組外周血mDC占淋巴細(xì)胞的百分比和CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞百分比均局灶性組、混合性組下降，而局灶性組與混合性組比較，其外周血mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞占比水平無差異，該結(jié)果提示mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞數(shù)下降可能參與了腎組織的急性病理損傷。

綜上，本文發(fā)現(xiàn)MPA患者外周血mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞下降與疾病活躍度及腎組織急性病理損傷有關(guān)。由于入選患者樣本量較少，下一步需要增加樣本量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證，同時mDC細(xì)胞與CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞相互作用導(dǎo)致MPA病變進(jìn)展的機(jī)制有待研究。