劉少洋，韓 容，李志新

（長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025）

水稻（Oryza sativaL.）是世界主要農(nóng)作物之一，是中國播種面積最大、總產(chǎn)量最多和單產(chǎn)量最高的糧食作物。中國約67%的人口以水稻為主食［1］，其在糧食消費和生產(chǎn)中也一直處于主導地位。因此水稻的種質創(chuàng)新及其功能基因組的研究顯得尤為重要。

水稻基因組較小，是單子葉禾本科植物基因組研究的模式植物，其物理圖譜和遺傳圖譜已經(jīng)構建完成［2］。水稻基因組測序于2002 年完成，為水稻基因功能的預測、鑒定、驗證和改良奠定了堅實基礎。研究者發(fā)現(xiàn)建立飽和突變體庫是水稻基因功能研究中最方便最有效的方法［3］，不僅可以發(fā)掘新基因，豐富水稻的種質資源，還能為水稻的功能基因組學和育種研究提供基礎材料。

1 獲取突變體的方法

從人類食用水稻開始，就一直在自然誘變中篩選有利變異體。隨著人類技術的提高，發(fā)現(xiàn)可以通過理化誘導獲得新的變異體。1927 年，Muller 利用X 射線處理果蠅得到可以遺傳的變異。隨后物理誘變被廣泛應用到農(nóng)作物上，還有一種特殊的物理誘變技術——航天誘變，在20 世紀80 年代由于返回式衛(wèi)星的運用而產(chǎn)生?；瘜W誘變在1941 年被證實可以誘發(fā)基因突變［4］，從此理化誘變成為誘變的主流。1953 年，DNA 的雙螺旋結構模型和半保留復制假說被首次提出后，現(xiàn)代分子生物學開始進入飛速發(fā)展的時期。1972 年，轉基因技術首次在大腸桿菌中取得成功［5］。1983 年，轉基因煙草問世［6］。轉基因技術的發(fā)展，衍生出一種構建突變體的方法——插入突變。插入突變是將外源基因隨機導入到受體基因組中，阻礙或干擾插入位點基因的表達，從而產(chǎn)生突變的方法。由于插入突變是隨機導入的，會造成很多不確定性，為了解決這一問題，基因編輯技術CRISPR/Cas 系統(tǒng)應運而生。2013 年發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是目前最廣泛和最受歡迎的編輯技術，可以比較精確地對受體基因組的目的基因進行定向修飾。獲取突變體的幾種常見方法以及優(yōu)缺點描述如下。

1.1 自然誘變

自然誘變也稱自發(fā)突變，是指在自然條件下DNA 復制、轉錄修復時偶爾出現(xiàn)堿基互補配對錯誤產(chǎn)生的突變。自從馴化植物開始，人類就有意或無意地對其進行篩選和利用，自然誘變加上人工選擇對水稻的進化起到了重要作用。雖然自發(fā)突變頻率很低，但其所產(chǎn)生的變異體有時會產(chǎn)生“革命性”的效果。1956 年，廣西壯族自治區(qū)容縣發(fā)現(xiàn)并育成了水稻矮桿品種矮仔占，1957 年，在廣東省發(fā)現(xiàn)了水稻自發(fā)突變個體矮腳南特，以及中國臺灣省的野生型水稻低腳烏尖等。這些變異的矮桿水稻產(chǎn)量大幅度提升，對中國水稻育種史產(chǎn)生了重大而深遠的影響，被稱為水稻的“第一次綠色革命”，具有里程碑式的意義。2002 年，圖位克隆出了綠色革命基因，矮桿基因sd1。sd1位于第一號染色體上，是控制水稻株高的基因，該基因使作物株高降低的同時還提高了有效穗和結實率［7］。研究者還從自發(fā)突變中克隆出了單蘗基因MOC1［8］、白葉枯病抗性基因Xa21［9］、香味基因Badh2［10］等，這些基因都廣泛應用在水稻育種領域。

自然誘變?nèi)菀壮霈F(xiàn)重要的有益基因，但由于其突變頻率低，一般為了大規(guī)模地獲取水稻變異體，需要建立突變體庫，還需要人工干預。

1.2 物理誘變

物理誘變最常用的方法是輻射。輻射誘發(fā)產(chǎn)生可以遺傳的變異，如染色體重排、斷裂或堿基突變導致細胞分裂異常，從而加速突變速率［11］。物理誘變操作簡單，誘變頻率高，但不能定向控制，有時候會出現(xiàn)大面積的片段缺失，有利變異頻率低。物理誘變中最常用的射線是60Co-γ［12］，輻照處理的劑量一般為（300±50）Gy，一般產(chǎn)生較小片段缺失。國際原子能機構（IAEA）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）建立的輻射誘變突變體數(shù)據(jù)庫，截至2021 年7 月，數(shù)據(jù)庫中植物突變品種總數(shù)已達3 365 個（http：//mvgs.iaea.org/）。柳夢林等［11］將浙粳99 通過輻射誘變后，經(jīng)過農(nóng)藝性狀和品質分析，共獲得350 份不同類型的變異體。張莉等［13］研究分析黃華占和經(jīng)60Co-γ 射線后的突變體湘輻1821 的分子差異，結果表明，突變體的SNPs 變異主要以轉換為主，主要突變類型為點突變。

從輻射誘變的突變體中探索出的基因有影響水稻生育期的光周期敏感基因SE5［14］、黃綠葉基因CHLIpyl3［15］、白條紋轉綠基因WSL887［16］等。

隨著航天技術的發(fā)展，出現(xiàn)了新型的物理誘變方式——航天誘變，它屬于輻射誘變的一種，是利用太空環(huán)境的綜合作用使種子產(chǎn)生變異，而且有利變異較多的育種技術。中國從1987 年開始研究太空育種，至今已經(jīng)取得顯著進展，并且居于世界領先水平。李金國等［17］在1992 年將秈型水稻“86-70”搭載返回式衛(wèi)星進行太空誘變，選育出優(yōu)質品種贛早秈47 號。王慧等［18］在1996 年運用航天育種的方法，從特秈占13 的變異體中篩選并培育出水稻國審品種華航一號，其一般產(chǎn)量為6.75～7.50 t/hm2，高產(chǎn)可超過9.00 t/hm2，適宜中國南方大部分稻區(qū)，具有良好的市場前景。陳淳等［19］將感溫型水稻品種“華航31”號進行航天誘變和重離子誘變，鑒定出7 個Wx基因變異體，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，航天誘變的生理損傷與低劑量重離子輻射相似，而變異頻率與高劑量輻射相近。

1.3 化學誘變

用于種子處理的化學誘變劑主要有烷化劑（甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基乙基脲烷（NEU））、核酸堿基類似物、抗生素等，其中EMS 誘變應用最廣。常用的EMS 處理濃度為0.6%～0.8%，暗處理時間為4～22 h，篩選變異植株的最佳時期為誘變M2代。EMS 誘變是單一堿基替換導致的點突變［20，21］，C/G替換成T/A，最終造成了堿基替換，所以更易獲得全基因組飽和突變體庫。隨著近年來測序技術的發(fā)展，開發(fā)出MutMap、SIMM 等突變位點快速定位技術，使得EMS 誘變成為一種高效建立突變體庫的方法［22］。陳天子等［23］利用濃度為0.5%的EMS 處理秈稻9311，在M2代篩選出抗咪唑啉酮的水稻材料，經(jīng)過功能研究，發(fā)現(xiàn)是堿基替換導致的錯義突變。倪浩凌等［24］在水稻優(yōu)質品種黃華占構建的EMS 誘變突變體庫中選出部分M2突變體種子，從大田中篩選出9 個穗發(fā)芽突變體。呂軍等［25］利用EMS 誘導粳稻品種遼星1 號，在M2群體中篩選出葉色、株型、株高、穗型、粒型和胚乳淀粉等有明顯差異的變異體336份，為水稻品種改良提供了遺傳資源。

從化學誘變中定位的基因有水稻葉片衰老基因LPS1［26］、分蘗調控基因HTD3［27］、短窄旗葉基因SNFL1［28］、穗長基因PAL3［29］等。筆者所在的長江大學水稻遺傳育種課題組創(chuàng)建突變體庫主要采用物理、化學的誘變方法，目前已經(jīng)用輻射誘變構建了水稻9311 的突變體庫。同時在自然突變中找到一個由LR2基因調控的管壁增厚水稻突變體，LR2基因主要調控水稻莖厚、抗折力以及抗倒伏，已經(jīng)申請專利（專利號：ZL201910200830.1）［30］。

1.4 體細胞克隆變異/體細胞無性系變異

植物細胞和離體組織經(jīng)過脫分化、擴增和再分化3 個階段產(chǎn)生再生植株的過程稱為組織培養(yǎng)，簡稱組培。組培產(chǎn)生的再生株中會產(chǎn)生大量的表型變異，被稱為體細胞克隆變異［31］，也稱體細胞無性系變異。在組培中，常會選用胚芽鞘、花藥、幼胚、成熟胚、幼穗及花藥等植物組織進行培養(yǎng)，其中最受歡迎的是成熟胚，愈傷組織誘導率最高［32］，且流程簡單方便。常用的基本培養(yǎng)基有N6、NB、MS、LS 等，其中N6 基本培養(yǎng)基在水稻中比較受歡迎，粳稻誘導率最高［33］，且利于秈稻愈傷組織的誘導［34］。1978 年Henke 等［35］在水稻再生植株培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)部分農(nóng)藝性狀產(chǎn)生變異，如穗長、分蘗以及株高等。隨著認識的深入，了解到體細胞克隆變異的機理，主要包括染色體變異、轉座子激活、DNA 甲基化、基因突變等［36］。龔志云等［36］在秈稻3037 無性繁殖過程中，發(fā)現(xiàn)一株長勢弱且不育的變異株，經(jīng)細胞學鑒定為第8 號染色體的單體，為水稻的功能基因組研究提供了一定的基礎。還有研究者從水稻組織培養(yǎng)中篩選出了早熟、矮稈、子粒較重［37］、抗白葉枯?。?8］、抗胡麻葉斑?。?9］等的水稻新品系。

1.5 植物轉基因技術

轉基因技術主要是通過農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等方法將目的基因導入受體基因組中，希望可以改變其原有性狀或產(chǎn)生新的性狀。農(nóng)桿菌介導法是讓含有目的基因的農(nóng)桿菌去侵染受體植株的傷口，從而實現(xiàn)外源基因與受體植株基因的整合。該方法具有成本低廉、操作簡單等特點?；驑尫?，又稱微彈轟擊技術，將外源基因包裹在金粉或鎢粉表面，利用高壓產(chǎn)生動力將其射入受體細胞整合到受體的基因組中。該方法不受基因型限制，但轉化成本較高、設備昂貴、轉化效率低?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ抢没ǚ墼谥^上萌發(fā)形成花粉管，外源DNA 經(jīng)花粉管通道進入胚囊，整合到受體植株基因組得到變異的種子。該方法操作簡單、成本低廉、利于推廣。轉基因技術有非定向即隨機插入和定向即精確插入2 種，非定向的代表有插入突變技術，定向的有基因編輯技術。

1.5.1 插入突變 插入突變是將已知的插入元件利用一定方法導入到受體植株的基因組中，希望產(chǎn)生具有不同表型的突變植株。主要采用的插入元件有T-DNA 和轉座子（如Ac/Ds，En/Spm-dSpm）、反轉座子（如Tos 17）［40］等。T-DNA 來源于根瘤農(nóng)桿菌的Ti質粒，一般以單拷貝插入為主，所以一旦T-DNA 整合到受體的基因組中，后代就會符合孟德爾遺傳特性且長期穩(wěn)定遺傳［41，42］。轉座子又稱跳躍基因，是一段可以自主復制并能在生物染色體間移動的DNA 序列。在水稻中，最常用的是2 個來自玉米的轉座子Ac/Ds［43］和En/Spm-dSpm［44］。反轉座子是通過RNA 反轉錄成DNA 后再進行轉座的可移動元件。最常用的是Tos17，在組培過程中被激活，其再生系可以直接在田間種植，收獲的種子不受轉基因條款約束。

崔永禎等［45］將冷誘導基因Cbcor15a利用農(nóng)桿菌介導技術侵染水稻品種日本晴，經(jīng)PCR 檢測，找到6 株轉化苗。劉華等［46］將箭竹DNA 利用花粉管通導入到水稻中，篩選出21 個穩(wěn)定遺傳的變異株。李廣信等［47］利用花粉管通道法將高粱的全基因組導入到水稻遼鹽28 號、遼鹽6 號中，獲得農(nóng)藝性狀均有明顯差異的27 個穩(wěn)定株系，為水稻遺傳和育種研究提供了材料。

1.5.2 基因編輯 基因編輯又稱基因組工程，是一種對生物體特定基因進行編輯修飾的技術。目前運用最廣的編輯技術是CRISPR/Cas9，可以相對精確地識別并修飾DNA 的特定位置。吳嫻等［48］通過CRISPR/Cas9 技術改良優(yōu)質大米大粒香，篩選出9 株稻瘟病抗性有明顯提高且米質不變的突變體。莫天宇等［49］將水稻東農(nóng)427 中耐鹽負調控基因OsEIL1和OsEIL2通過CRISPR/Cas9 技術敲除后，篩選出耐鹽性明顯提高的突變植株。Hui 等［50］在粳稻品種寧粳1 號（NJ1）和秈稻品種黃華占（HHZ）的遺傳背景下，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術創(chuàng)制了新BADH2等位基因，為三系雜交稻香味改良提供重要的遺傳資源。Wang 等［51］通過CRISPR/Cas9 技術對水稻中3 個減數(shù)分裂基因PAIR1、REC8、OSD1和參與受精的基因MTL進行多重編輯，發(fā)現(xiàn)可以通過該方法進行雜種優(yōu)勢的固定，解決雜交種子生產(chǎn)成本高的問題，具有廣闊的應用前景。

對幾種誘變方法進行分析比較，結果見表1。當前使用較多的是化學誘變中的EMS 誘變，操作簡單且因為是單堿基導致的點突變，突變穩(wěn)定快，篩選到突變體后，即可以簡單地通過MutMap 技術分離出突變基因，非常有利于遺傳學和育種學研究。另一種是基因編輯技術中的CRISPR/Cas9 技術，它相當于一次突變的革新，可以定點地、精準地編輯目的基因，應用前景廣闊。

表1 誘變方法的優(yōu)缺點比較

2 鑒定突變體的方法

2.1 表型鑒定

表型鑒定即農(nóng)藝性狀鑒定，主要是鑒定生育期、分蘗、株高、葉色、株型、葉型、穗型、育性、粒形、莖稈顏色及生理指標等性狀的變化。表型鑒定要求變異體相對于野生型有較明顯的差異，并且該變異可以穩(wěn)定遺傳。

任伊佳等［52］利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變秈稻品種黃華占，在自然環(huán)境下，經(jīng)過田間觀察整個生育期類病斑的產(chǎn)生情況，最終獲得一個穩(wěn)定遺傳的水稻類病斑突變體spl41。葛倩雯等［53］將水稻rld卷葉矮化突變體與粳稻野生型品種日本晴雜交，在成熟期通過測量劍葉葉片來篩選目的植株。林靜霞等［54］利用化學誘變水稻品種Kasalath，通過對根系的長短、植株的高度、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀表型進行分析，得到一個短根突變體ksr8，為水稻根系發(fā)育的后續(xù)研究提供了材料支持。

2.2 細胞學鑒定

細胞學鑒定主要是通過觀察細胞及細胞器形態(tài)的變化來研究誘變的機理，其主要操作方法是通過電鏡進行觀察。劉林等［55］對來自粳稻品種寧粳6 號化學誘變突變體庫的水稻白穗突變體white panicle8，用透射電鏡觀察幼苗期和成熟期葉片，發(fā)現(xiàn)大部分葉綠體發(fā)生降解，一些僅存的葉綠體中類囊體片層結構消失并出現(xiàn)大量嗜鋨體和空泡狀結構。呂軍等［56］分析水稻心白突變體xb1，用電鏡掃描和激光粒度儀觀察淀粉粒的粒徑分布情況，證明了突變體的淀粉合成過程發(fā)生了異常。尚麗娜等［57］利用透射電鏡觀察水稻溫敏型葉片白化轉綠突變體，發(fā)現(xiàn)不同溫度下葉綠體的發(fā)育情況不同。張濤薈［58］等利用I2-KI 染色法觀察野生型寧粳4 號和其突變體花粉育性，最終篩選到穩(wěn)定的不育突變體，并克隆了雌雄不育基因OsFMA2。

2.3 同工酶鑒定

不同品種由于遺傳物質不同，所以具有獨特的特征酶帶。同工酶鑒定突變體的基本原理是通過酶譜的差異來判斷是否產(chǎn)生突變體。檢測常用的同工酶有過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶。李廣信等［59］將高粱DNA 導入水稻中，利用酯酶同工酶分析其親本及后代，發(fā)現(xiàn)其后代顯示出受體材料中沒有，但與供體材料相似的酶帶，表明子代獲得了高粱的DNA，豐富了水稻育種材料。姜軍劍等［60］對酯酶同工酶的凝膠電泳酶帶進行分析，發(fā)現(xiàn)水稻溫敏核不育與常規(guī)水稻在幼穗分化期有明顯差別，為闡明溫敏核不育提供了理論依據(jù)。

2.4 分子鑒定

分子鑒定是研究核酸、蛋白質等所有生物大分子形態(tài)結構的變化，從分子層面挖掘變異體與野生型變化的一種方法。分子鑒定包括分子標記技術和測序技術。

分子標記技術包括蛋白質印跡法（Western blot）、RNA 印 跡 法（Northern blot）、DNA 印 跡 法（Southern blot）以及以Southern blot 和PCR 為基礎衍生的RFLP、SSR 以及SNP。陳受宜等［61］將經(jīng)EMS 誘導和鹽脅迫產(chǎn)生的粳稻耐鹽突變體利用水稻RFLP連鎖圖，用130 個標記做探針，經(jīng)過RFLP 分析，在第七對染色體上找到突變位點。樸日花等［62］利用PCR 法對水稻穗退化T-DNA 突變體的插入突變體基因型進行鑒定，篩選到2 個純和突變體。郝宏嬌等［63］篩選了一個早抽穗的T-DNA 插入突變體，利用熱不對稱性PCR（TALL-PCR）技術研究發(fā)現(xiàn)，突變體的插入導致富亮氨酸類受體激酶基因功能喪失，為后續(xù)基因研究奠定了基礎。寧敏等［10］利用4 個已知香味基因的分子標記，通過PCR 分子標記技術輔助選擇鑒定出83 份含有香味基因的水稻材料，均為外顯子缺失，且秈稻居多。陶英瑜等［64］利用CRISPR/Cas9 技術敲除水稻品種日本晴中的OsABI5基因后，通過PCR 技術和Western blot 篩選得到陽性突變株，為調控水稻種子萌發(fā)提供了理論基礎。

隨著測序成本的降低，對變異體材料直接進行序列分析成為可能?，F(xiàn)在的EMS 誘變普遍采用MutMap 技術來檢測突變位點。Kim 等［65］利用TILLING 技術處理日本晴，暫定了37 個突變體，后通過Sanger 測序證實了6 個突變體，其中有一個突變體與野生型的支鏈淀粉長度有顯著差別。Cao 等［66］利用EMS 對秈稻品種9311 進行誘變，通過MutMap 和RNA-seq 技術鑒定并分析了突變體lcd1與低鎘積累表型相關的候選SNP 位點及其轉錄組變化。Wang等［67］利用改良的MutMap 方法鑒定了水稻突變體wb1，得知其胚乳發(fā)育是由調控因子WB1來調控的，為培育新的品質性狀提供種質基礎。

3 展望

本研究介紹了變異體的5 種創(chuàng)制方法和4 種鑒定方法。創(chuàng)造豐富的水稻突變體是遺傳學和育種學研究的重要基石，需要多種方法相互結合，單一方法誘導突變體，其變異范圍和類型存在一定的局限。為了提高水稻的突變頻率、擴大變異率，現(xiàn)在更多的是向多種方法結合的方向發(fā)展，比如在組織培養(yǎng)的過程中施加理化誘變的因素使其產(chǎn)生更多的變異，基因編輯也不僅限于單個基因，也朝著多基因及基因組編輯的方向發(fā)展，將會有更豐富的變異體材料出現(xiàn)。