李慶妍 劉 東

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌的80%左右，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，嚴(yán)重危害人們的生命健康。表皮生長因子受體（EGFR）作為Her/ErbB受體家族的一員，是一種位于細(xì)胞表面的酪氨酸激酶（TK）受體，在與配體結(jié)合后發(fā)生二聚化，從而促進(jìn)下游信號(hào)通路的激活，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。吉非替尼作為首個(gè)表皮生長因子酪氨酸激酶受體抑制劑（EGFR-TKIs）靶向藥物，可用于治療轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌EGFR 19 del或外顯子21 L858R突變患者。盡管EGFR陽性突變的NSCLC患者經(jīng)吉非替尼治療后無進(jìn)展生存期顯著延長，但大部分的患者在治療后幾個(gè)月就出現(xiàn)耐藥[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明EGFR基因突變（如Kras突變）、二次基因突變（如T790M突變約占50%）以及旁路的激活等可能是EGFR-Tki原發(fā)/繼發(fā)性耐藥的重要機(jī)制，但具體機(jī)制仍不明確。因此探究吉非替尼耐藥機(jī)制，對(duì)于療效預(yù)測及克服腫瘤耐藥具有重要的意義。近年來，不涉及基因序列改變的表觀遺傳學(xué)機(jī)制在腫瘤耐藥中的作用日益受到關(guān)注，且成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。表觀遺傳修飾包括非編碼RNA（non-coding RNAs）調(diào)控、DNA甲基化和組蛋白修飾等，可以在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因表達(dá)、維持基因組穩(wěn)定性[2]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)異常在EGFR-TKI耐藥中發(fā)揮重要作用。因此，本文綜述了NSCLC靶向治療獲得性耐藥中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，以期為EGFR-TKIs耐藥開發(fā)新的對(duì)策提供幫助。

1 非編碼RNA調(diào)控

非編碼RNA包括LncRNAs、miRNAs等，但對(duì)于基因調(diào)控具有多種生物學(xué)功能，并與NSCLC耐藥密切相關(guān)。

miRNAs是一種長度為18～25個(gè)核苷酸的小的非編碼調(diào)控RNA，在癌癥起始和進(jìn)展過程中對(duì)幾乎所有失調(diào)特征都有調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和凋亡。許多miRNAs通過靶向EGFR信號(hào)通路在癌癥治療過程中具有特定的調(diào)控作用；miR21是研究最多的關(guān)于EGFRTKIs的miRNA，在肺癌細(xì)胞的生長和侵襲過程中表達(dá)上調(diào)。miR21表達(dá)抑制了EGFR突變體NSCLC細(xì)胞中PTEN（抑癌基因）和程序性死亡4基因（PDCD4）的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFRTKI藥物敏感性下降，出現(xiàn)耐藥。它還對(duì)PI3K/AKT通路的激活有調(diào)節(jié)作用，其通過抑制PI3K/AKT通路來逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥性[3]和miR214的過表達(dá)。間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子（MET）擴(kuò)增是吉非替尼獲得性耐藥最常見的替代途徑，而miR130a的表達(dá)與MET呈負(fù)相關(guān)。miR130a通過與MET的3'-UTR結(jié)合抑制其表達(dá)，故miR130a過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥性[3]。而miR181a的過表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致其靶基因GAS7（生長停滯特異蛋白7）表達(dá)下調(diào)，從而拮抗吉非替尼在耐藥細(xì)胞的敏感性[4]。除此之外，miR153的表達(dá)下調(diào)和miR214的過表達(dá)均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFRTKIs的耐藥[1]。

LncRNAs是一種長度大于200個(gè)核苷酸的線性RNA，在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。Wang Z等[5]對(duì)63例晚期肺腺癌患者的組織標(biāo)本測定，用吉非替尼處理后發(fā)現(xiàn)獲得性耐藥組中LncRNA SNHG5顯著下調(diào)，在原發(fā)性吉非替尼耐藥組患者中沒有差異。另有研究[6]則發(fā)現(xiàn)LINC00460與EGFR表達(dá)呈正相關(guān)，miR-769-5p與EGFR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。由此推測Lnc00460的過表達(dá)和LncRNA SNHG5的表達(dá)沉默均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥。王守忠等[7]用不同濃度的吉非替尼處理肺癌細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測吉非替尼耐藥細(xì)胞中LncRNA GIHCG 與miR-204-5p的表達(dá)，用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證LncRNA GIHCG 與miR-204-5p的靶向關(guān)系，證明了LncRNA GIHCG通過靶向調(diào)控miR-204-5p的信號(hào)通路，使得肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥。而陳晨等[8]發(fā)現(xiàn)GAS5（生長停滯特異蛋白5）的過表達(dá)與EGFR通路呈負(fù)相關(guān)，并能夠逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥。

因此，研究非編碼RNA可能為未來逆轉(zhuǎn)吉替尼耐藥提供一個(gè)治療靶點(diǎn)。

2 組蛋白修飾

染色質(zhì)是由DNA、組蛋白和非組蛋白組成的復(fù)合物，組蛋白是一種小的、帶正電荷的蛋白質(zhì)。H2A、H2B、H3、H4四對(duì)核心組蛋白與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，共同形成的八聚體稱為核小體。組蛋白伸出核小體外的氨基末端通過多種翻譯后修飾來改變核小體的松緊結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因表達(dá)[9]。組蛋白修飾包括乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化、丁基化等。這些修飾方式依賴組蛋白修飾酶作用，這些酶能夠“寫入”“讀取”或“擦除”表觀遺傳標(biāo)記，成為潛在的治療靶點(diǎn)。

各種研究表明，靶向外蛋白質(zhì)組蛋白修飾可以改善腫瘤的耐藥性?，F(xiàn)有研究表明HDACs在癌癥中經(jīng)常過表達(dá)，并已成為潛在的治療靶點(diǎn)。BCL-2相互作用的細(xì)胞死亡介質(zhì)（BIM）是促凋亡蛋白BCL-2家族成員之一，BIM缺失會(huì)使TKIs無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs耐藥。伏立司他（一種HDAC抑制劑）已被證明可以恢復(fù)BIM的功能，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、不可逆生長抑制及凋亡，進(jìn)而恢復(fù)EGFR突變和吉非替尼耐藥的NSCLC對(duì)吉非替尼的敏感性[10]。還有研究[11]發(fā)現(xiàn)p300或CREB結(jié)合蛋白（CBP）通過組蛋白乙酰化促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而p300/CBP抑制劑A485與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體聯(lián)合治療對(duì)EGFR-TKIs耐藥的NSCLC，發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)量增加，并對(duì)細(xì)胞增殖有長期抑制作用。而TCN19（一種新型的EGFR和肝細(xì)胞生長因子受體雙重抑制劑）則是通過泛素蛋白酶降解組蛋白，從而誘導(dǎo)耐藥的EGFR突變NSCLC細(xì)胞凋亡，克服了吉非替尼耐藥性[12]。

3 DNA甲基化

近年來，DNA甲基化是腫瘤表觀遺傳學(xué)中的研究熱點(diǎn)。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中，其中一個(gè)甲基被添加到胞嘧啶的第5位碳原子上。在正常生理?xiàng)l件下，它是一種動(dòng)態(tài)平衡，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和DNA去甲基化酶調(diào)控，對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控和異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要影響。研究表明，腫瘤抑癌基因CpG島啟動(dòng)子中的基因特異性高甲基化和全基因組低甲基化可能與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

DNA甲基化穩(wěn)態(tài)的破壞與NSCLC靶向治療獲得性耐藥具有相關(guān)性。原發(fā)性或獲得性耐藥的腫瘤細(xì)胞大多伴隨DNA異常甲基化，且可能是腫瘤細(xì)胞耐藥表型產(chǎn)生的重要機(jī)制。已有研究表明EGFR基因CpG島的甲基化參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。隨后國內(nèi)外研究者也對(duì)于靶向藥物（包括EGFR TKI）耐藥機(jī)制進(jìn)行了系列探索研究，發(fā)現(xiàn)基因異常的甲基化可能導(dǎo)致靶向藥物治療敏感性降低。國內(nèi)學(xué)者馮繼鋒研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)EGFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1650對(duì)吉非替尼獲得性耐藥的機(jī)制之一[13]。王起龍等[14]利用重亞硫酸鹽測序法（bsp）對(duì)人肺腺癌pc9/gr耐藥細(xì)胞株的EGFR基因甲基化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)吉非替尼可能通過EGFR啟動(dòng)子甲基化誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥。天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所在細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)EGFR且EGFR基因CpG島高甲基化的細(xì)胞系對(duì)吉非替尼不敏感，而后的去甲基化治療可明顯改善吉非替尼治療的敏感性[15]。在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型上得到驗(yàn)證后，開始了一系列真實(shí)世界的探索研究。Nguyen HN等[16]在對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥的122例患者檢測結(jié)果顯示有多個(gè)基因調(diào)控區(qū)域出現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，其中一組參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長和分化的基因是Homeobox（HOX）基因。Shu SF等[17]通過對(duì)79例服用EGFR-TKIs的晚期肺腺癌患者的全基因組DNA甲基化分析和163例EGFR突變患者的焦磷酸測序，構(gòu)建了一個(gè)DNA甲基化圖譜，其中包含216個(gè)甲基化CpG位點(diǎn)，通過分析發(fā)現(xiàn)HOXB9的高甲基化可能與EGFR-TKIs的耐藥有關(guān)。相關(guān)研究[10]通過對(duì)正常組織、腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤細(xì)胞的對(duì)比發(fā)現(xiàn)EGFR的CpG島甲基化使得mRNA表達(dá)缺失，從而導(dǎo)致EGFR表達(dá)沉默，使得EGFR突變的實(shí)體腫瘤細(xì)胞系對(duì)吉非替尼耐藥。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTIs）地西他濱聯(lián)合吉非替尼治療則可以改善腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性，恢復(fù)靶向藥物治療的敏感性。Song H等[18]用5-AzaCdR（一種DNMTIs）處理PC9/GR（存在T790M突變的吉非替尼耐藥細(xì)胞系）后，死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)由高變低，而腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性則由低變高。該實(shí)驗(yàn)證明了PC9/GR細(xì)胞系的DAPK基因啟動(dòng)子處于甲基化狀態(tài)，可降低DAPK基因的表達(dá)甚至缺失，下調(diào)DAPK蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致吉非替尼耐藥。

由此可見，多種基因的甲基化可能參與了吉非替尼耐藥，大多研究僅限于細(xì)胞水平及動(dòng)物模型，對(duì)于其真實(shí)世界研究較少，并且由于檢測方法的限制，僅能判定DNA甲基化定性，對(duì)于EGFR等基因具體甲基化水平（定量）、耐藥相關(guān)的差異性甲基化CpG位點(diǎn)（定位）的檢測篩選存在困難，因此探究非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼耐藥后基因具體甲基化狀態(tài)及尋找耐藥相關(guān)差異性甲基化CpG位點(diǎn)至關(guān)重要。

4 總結(jié)與展望

EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，不同的機(jī)制之間也可以相互影響。在主要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制中，DNA甲基化可能是研究最多的，值得注意的是，腫瘤的表觀遺傳變化通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)模式參與了獲得性耐藥性的進(jìn)化，但仍缺少相關(guān)的表觀基因組定量數(shù)據(jù)。本課題組結(jié)合前人研究基礎(chǔ)深入研究并探討DNA甲基化相關(guān)的耐藥機(jī)制，篩選靶向治療療效預(yù)測及耐藥相關(guān)甲基化CpG位點(diǎn)，可能作為EGFR-TKI療效預(yù)測的分子標(biāo)志物，同時(shí)為后續(xù)研發(fā)去甲基化藥物的治療提供精準(zhǔn)靶點(diǎn)，更好地指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)靶向用藥。由于 DNA啟動(dòng)子甲基化是一個(gè)可逆的過程，表觀遺傳干預(yù)如去甲基化藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用可能是逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥的有效治療策略。