高 芳 吳婉琴 王 彬 劉國姣 江 豐

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí)，主要產(chǎn)地有四川、云南、安徽、廣西等地[1]。補(bǔ)骨脂中含有香豆素類、黃酮類、單萜酚類、擬雌內(nèi)酯類等多種化學(xué)成分[2-4]，是一味具有較高關(guān)注度的藥材?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素均有肝毒性，補(bǔ)骨脂酚具有腎毒性，其中一些補(bǔ)骨脂提取物還具有胚胎毒性[5-8]，因此其在藥物制劑和保健食品中的使用也受到一定的限制。中國《食品安全法》第三十八條明確規(guī)定“生產(chǎn)經(jīng)營的食品中不得添加藥品，但是可以添加按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)”。2018年衛(wèi)健委公布的可用于保健食品的中藥名單中包含補(bǔ)骨脂，但未將其列入可用于食品中的中藥材名單中。一些不法商家僅看到其臨床的藥用價(jià)值，非法在市售的酒和代用茶等普通食品中添加補(bǔ)骨脂。

現(xiàn)有的中藥材非法添加鑒別手段，主要有薄層鑒別[9]、DNA條形碼分子鑒定[10]、中藥材特征圖譜或指紋圖譜鑒定[11-12]等方法，由于食品種類的多樣性及其本身基質(zhì)的復(fù)雜性，在食品中通過各種加工工藝摻入的中藥材，其指紋圖譜及特征圖譜均有較大的改變，而現(xiàn)有的中藥材鑒別手段一般只適用于中藥材原料本身，對(duì)于在食品中非法加入的中藥材并不能起到很好的鑒別作用。已有的補(bǔ)骨脂中藥材研究[13-15]均只限于其藥理活性、藥材指紋圖譜、化學(xué)組成成分及其含量的測(cè)定，尚未見有對(duì)其非法添加到食品的報(bào)道。診斷比值(Diagnostic ratio，DR)是指樣品中某些特定組分之間的比值，能夠表征不同樣品各自的化學(xué)組成，用于判別兩個(gè)樣品是否一致。其特征是有獨(dú)特性和差異性，基本不受外界因素影響或受外界因素影響較小。目前主要運(yùn)用于化學(xué)品溯源鑒別[16-17]、醫(yī)學(xué)疾病診斷[18]等領(lǐng)域，而在食品中中藥材鑒別方面還鮮有報(bào)道。將中藥材特征組分診斷比值法用于食品中非法添加中藥材的鑒別，可以使分析者在不依賴特征組分指紋圖譜庫的情況下進(jìn)行食品中中藥材鑒別，極大限度地縮短鑒別時(shí)間，降低鑒別的復(fù)雜性。

為了建立一種簡(jiǎn)單易行且可靠的鑒別食品中非法添加補(bǔ)骨脂中藥材的方法，采用高效液相色譜—四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀建立補(bǔ)骨脂中藥材特征組分篩查庫，再選取補(bǔ)骨脂的13種特征成分(補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂苷二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂定、Corylifol A、補(bǔ)骨脂查爾酮和補(bǔ)骨脂酚)為考察對(duì)象，選取常見易非法添加中藥材的配制酒和代用茶為研究對(duì)象，于高效液相色譜探索出基于特征組分的診斷比值法確證配制酒和代用茶中違法添加補(bǔ)骨脂中藥材的鑒定技術(shù)，構(gòu)建配制酒和代用茶中非法補(bǔ)骨脂確證技術(shù)體系，旨在為配制酒和代用茶中補(bǔ)骨脂中藥材非法添加的科學(xué)監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

補(bǔ)骨脂中藥材(采用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理后過二號(hào)篩得補(bǔ)骨脂粗粉，置于密封袋中，20批次補(bǔ)骨脂中藥材編號(hào)為S1-S20，樣品的具體信息見表1):市售；

表1 樣品信息

20批次配制酒：市售；

10批次代用茶：市售；

補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)中藥材：中國食品藥品檢定研究院；

補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂苷二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂定、Corylifol A、補(bǔ)骨脂查爾酮和補(bǔ)骨脂酚：純度≥98%，上海源葉生物技術(shù)有限公司；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

磷酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

超純水：電阻率為18.2 MΩ·cm(25 ℃)，美國 Millipore公司。

1.1.2 主要儀器

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國Thermo公司；

串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：AB Sciex TOF 5600+型，配備Analyst 1.6工作站、Peak View定性篩查軟件、Library View數(shù)據(jù)庫軟件，美國SCIEX公司；

高效液相色譜儀：Waters e2695型，美國Waters公司；

光電二極管陣列檢測(cè)器：Waters 2998型，美國Waters公司；

離心機(jī)：Allegra X-15R型，美國Beckman公司；

超聲波清洗器：EDAA-2600T型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

分析天平：ME2002E型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易上海有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儀器分析條件

(1) HPLC-TOF-MS分析條件：色譜柱為Thermo Accucore aQ色譜柱(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液，梯度見表2。

表2 流動(dòng)相梯度程序

(2) TOF/MS工作條件：離子源為電噴霧離子源；正離子掃描模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣241 kPa；霧化氣379 kPa；輔助氣379 kPa；去簇電壓60 V；碰撞能量35 V；掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍100～1 000 Da；全掃描二級(jí)質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍50～1 000 Da。質(zhì)量數(shù)校正液為10 mmol/L甲酸鈉溶液。

(3) TOF/MS篩查高分辨質(zhì)譜庫篩查條件：鑒別參數(shù)設(shè)置：化合物提取離子流響應(yīng)強(qiáng)度>100或信噪比S/N>5，母離子精確分子量和二級(jí)碎片質(zhì)量數(shù)偏差設(shè)為±0.001%，保留時(shí)間偏差±2.5%；數(shù)據(jù)庫綜合得分設(shè)置：質(zhì)量數(shù)偏差、保留時(shí)間偏差、同位素比值、分子式匹配、數(shù)據(jù)庫匹配占比均設(shè)為20%。

(4) HPLC分析條件：色譜柱為Waters Symmetry Shield C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相 A為乙腈；流動(dòng)相 B為0.05% 磷酸水溶液，梯度見表3。

表3 流動(dòng)相梯度程序

1.2.2 溶液的制備

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂苷二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂定、Corylifol A、補(bǔ)骨脂查爾酮和補(bǔ)骨脂酚標(biāo)準(zhǔn)品適量于10 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容，分別得到質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取上述13種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度均為0.05 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃環(huán)境中冷藏避光保存。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)中藥材溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)骨脂中藥材適量，用50%甲醇水溶液提取超聲，浸提24 h以上，稀釋后上清液過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜—四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測(cè)用。

(4) 模擬補(bǔ)骨脂酒的制備及前處理：稱取補(bǔ)骨脂中藥材1 g(精確至0.01 g)置于棕色廣口瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL 50%乙醇水溶液，超聲30 min，取出放至室溫，浸提24 h以上。取上清液過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜儀檢測(cè)用。

(5) 模擬補(bǔ)骨脂代用茶的制備及前處理：稱取補(bǔ)骨脂中藥材1 g(精確至0.01 g)置于具塞離心管中，準(zhǔn)確加入50%甲醇水溶液，超聲30 min，取出放至室溫，于4 000 r/min 離心5 min。取上清液過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜儀檢測(cè)用。

(6) 配制酒：取適量樣品，于4 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜—四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測(cè)用。

(7) 代用茶：準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.01 g)樣品置于具塞離心管中，準(zhǔn)確加入50 mL 50%乙醇水溶液，超聲30 min，取出放至室溫，于4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，供高效液相色譜—四極桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀檢測(cè)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)骨脂中特征化學(xué)組分篩查庫的建立

正離子掃描模式下，比較考察了乙腈—5 mmol/L乙酸銨和乙腈—0.1%甲酸2種流動(dòng)相體系，部分化合物在乙腈—5 mmol/L乙酸銨流動(dòng)相體系下峰形不佳出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且峰響應(yīng)較差，故選擇乙腈—0.1%甲酸流動(dòng)相體系進(jìn)行分析。為得到更全面的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，設(shè)定全掃描一級(jí)質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍100～1 000 Da，全掃描二級(jí)質(zhì)譜，質(zhì)量采集范圍50～1 000 Da。優(yōu)化HPLC-TOF-MS條件下補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)中藥材中提取得到的13種特征組分精確離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表4，同分異構(gòu)體按照對(duì)照品出峰先后順序定位，根據(jù)分辨質(zhì)譜所得到的化合物質(zhì)譜參數(shù)可用于初步篩查食品中的補(bǔ)骨脂藥材。

表4 補(bǔ)骨脂特征組分信息表

2.2 特征組分的選擇

上述優(yōu)化的HPLC色譜條件，補(bǔ)骨脂中13種特征組分能夠得到較好的分離，其混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖見圖1(a)，自采模擬的補(bǔ)骨脂酒和代用茶溶液色譜圖見圖1(b)，將該色譜條件下得到的20批模擬的補(bǔ)骨脂酒和代用茶中13種特征組分的峰面積分別進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)診斷比值法的定義選擇樣品特征組分色譜峰的面積比值來分析，共有91種診斷比值的組合，但是由于所采購的補(bǔ)骨脂中藥材產(chǎn)地和采摘時(shí)間，其摻加比例和提取過程、化合物本身性質(zhì)等不同，所得到的各特征組分含量有很大的差異，優(yōu)先考慮其中含量較高的特征成分，在補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)藥材中補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、Corylifol A和補(bǔ)骨脂酚都是含量較高的組分，考慮特征成分的穩(wěn)定性，包括受外界環(huán)境因素、時(shí)間和雜質(zhì)的干擾，其中補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷受時(shí)間影響含量變化較大，同時(shí)考慮到陽性樣品中能檢測(cè)出的特征成分，結(jié)果從中選出各種因素影響較小，其診斷比值數(shù)值范圍較為集中的2組，即1 CoryliA/補(bǔ)骨脂酚(DR1)和補(bǔ)骨脂素/異補(bǔ)骨脂素(DR2)，模擬酒樣品中DR1數(shù)值集中在0.069～0.115，DR2數(shù)值集中在1.14～1.63，模擬代用茶樣品中DR1數(shù)值集中在0.061～0.101，DR2數(shù)值集中在1.24～1.68，其數(shù)值RSD均小于20%，具體診斷比值數(shù)據(jù)結(jié)果見表5 。

1. 補(bǔ)骨脂苷 2. 異補(bǔ)骨脂苷 3. 補(bǔ)骨脂素 4. 異補(bǔ)骨脂素 5. 異補(bǔ)骨脂二氫黃酮 6. 補(bǔ)骨脂二氫黃酮 7. 新補(bǔ)骨脂異黃酮 8. 補(bǔ)骨脂寧 9. 補(bǔ)骨脂苷二氫黃酮甲醚 10. 補(bǔ)骨脂定 11. Corylifols A 12. 補(bǔ)骨脂查爾酮 13. 補(bǔ)骨脂酚

表5 20批次補(bǔ)骨脂中藥材模擬酒和代用茶的特征組分診斷比值

2.3 不同食品基質(zhì)間診斷比值顯著性差異分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)選定的模擬配制酒和代用茶食品的2組診斷比值DR1和DR2進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果顯示(見表6)：2種食品基質(zhì)間各組診斷比值均無顯著性差異(P>0.05)，表明所選的2組診斷比值具有一定的穩(wěn)定性，不受樣品基質(zhì)、加工工藝和提取溶劑的干擾，可用于不同食品基質(zhì)中補(bǔ)骨脂中藥材的鑒別。

表6 配制酒和代用茶食品的診斷比值方差分析

2.4 診斷比值非異常范圍的確定

顯著性差異分析顯示2組診斷比值于不同基質(zhì)間均無顯著性差異，為更全面統(tǒng)一地對(duì)不同食品中補(bǔ)骨脂進(jìn)行鑒別，使方法具有一定的通用性，考慮將2種不同基質(zhì)的各診斷比值進(jìn)行合并，進(jìn)行箱圖繪制如圖2，確定各比值非異常值范圍，診斷比值DR1范圍為0.061～0.115，診斷比值DR2范圍為1.14～1.68。

圖2 食品中補(bǔ)骨脂中藥材的診斷比值箱線圖

2.5 基于診斷比值法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用建立的方法對(duì)市售20批次配制酒和10批次代用茶樣品進(jìn)行高分辨質(zhì)譜庫分析篩查及診斷比值法鑒別，其中4批次的配制酒高分辨數(shù)據(jù)均與自建質(zhì)譜庫13種特征組分匹配一致，均為標(biāo)簽標(biāo)注含補(bǔ)骨脂的藥酒，其樣品中補(bǔ)骨脂酚與標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)骨脂酚碎片離子鏡像圖如圖3所示，樣品中Corylifols A與標(biāo)準(zhǔn)品Corylifols A碎片離子鏡像圖如圖4所示，補(bǔ)骨脂素與標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)骨脂素碎片離子鏡像圖如圖5所示，異補(bǔ)骨脂素與標(biāo)準(zhǔn)品異補(bǔ)骨脂素碎片離子鏡像圖如圖6所示，說明所建的高分辨質(zhì)譜庫能夠快速地篩查出食品中非法添加的補(bǔ)骨脂，同時(shí)進(jìn)液相色譜分析，采用特征組分峰面積診斷比值法對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步確證。其色譜圖見圖1(c)，得到的4組陽性樣品診斷比值結(jié)果見表7，其診斷比值DR1和DR2均在上述繪制箱圖確定的非異常值范圍內(nèi)，證明該4批次配制酒樣品中確實(shí)含有補(bǔ)骨脂中藥材。

表7 陽性樣品的特征組分診斷比值

上半部分為配制酒樣品，下半部分為標(biāo)準(zhǔn)品

上半部分為配制酒樣品，下半部分為標(biāo)準(zhǔn)品

上半部分為配制酒樣品，下半部分為標(biāo)準(zhǔn)品

上半部分為配制酒樣品，下半部分為標(biāo)準(zhǔn)品

3 結(jié)論

研究開發(fā)出一種基于高分辨質(zhì)譜庫和特征組分診斷比值法快速篩查鑒別配制酒和代用茶中非法添加補(bǔ)骨脂中藥材的方法，選取11種特征組分構(gòu)建高分辨質(zhì)譜庫進(jìn)行初步篩查，最終確定穩(wěn)定性較好的CoryliA/補(bǔ)骨脂酚(DR1)和補(bǔ)骨脂素/異補(bǔ)骨脂素(DR2)2組診斷比值作為鑒別依據(jù)，并考察了特征比值在配制酒、代用茶葉中的顯著性差異，確定了2組診斷比值的非異常范圍，構(gòu)建了配制酒和代用茶中補(bǔ)骨脂中藥材確證技術(shù)體系。該方法簡(jiǎn)單高效，適用于配制酒和代用茶中補(bǔ)骨脂中藥材的檢測(cè)。