嚴(yán)承歡 崔 磊 任志勇 黃 燕，2 矯振彪 朱鳳娟 張振興 甘彩霞 鄧曉輝 邱正明*

（1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070）

蘿卜（L.）又名萊菔，屬于十字花科蘿卜屬植物，富含維生素、膳食纖維、植物蛋白質(zhì)、硫代葡萄糖苷等多種營養(yǎng)物質(zhì)。蘿卜的栽培歷史超過4 500 年，最早由古埃及人將其馴化并栽 培（Becker，1962；Zhang &Wang，2017）。在我國，蘿卜常年種植面積約120 萬hm，總產(chǎn)量約4 000 萬t（包崇來 等，2019）。肉質(zhì)根是蘿卜的主要食用器官，根據(jù)其皮色可分為白皮、綠皮、紅皮以及黑皮等類型，其中白皮蘿卜是目前最主要的栽培類型（崔志超 等，2020）。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已形成多種類型分子標(biāo)記，如限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多 態(tài) 性DNA 標(biāo) 記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）、插入/缺失標(biāo)記（insertion/deletion，InDel）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）等（Toal et al.，2016）。其中，RFLP、RAPD、AFLP 和SSR分子標(biāo)記在基因組中數(shù)目較少；SNP 分子標(biāo)記數(shù)量最多，但開發(fā)成本和檢測成本高昂。InDel 分子標(biāo)記具有標(biāo)記數(shù)目多、準(zhǔn)確性高以及共顯性等特點(diǎn)，但因其插入/缺失序列小于50 bp，需要采用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測（Shu et al.，2018）。若將插入/缺失變異提升至50 bp 以上序列，采用普通瓊脂糖凝膠電泳即可完成檢測，可顯著提升該類型標(biāo)記的檢測效率。一般而言，50 bp 以上的插入/缺失變異屬于基因組結(jié)構(gòu)變異（structural variants，SVs）范疇（Alkan et al.，2011）。目前，基因組結(jié)構(gòu)變異已廣泛應(yīng)用于人類的基因分型相關(guān)工作，但在植物中研究相對較少。在植物中，研究人員已利用SSR、InDel 等分子標(biāo)記構(gòu)建了甜高粱（王黎明等，2011）、甘藍(lán)型油菜（馬琳 等，2013）、水稻（陸徐忠 等，2014）、大白菜（劉栓桃 等，2019）和青花菜（管俊嬌 等，2021）等多個(gè)物種的分子身份證。然而，采用較大片段（50～500 bp）的插入/缺失變異開發(fā)易于檢測（如使用瓊脂糖凝膠即可檢測）的分子標(biāo)記，并以此構(gòu)建分子身份證的研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)采用最近報(bào)道的520 份蘿卜簡化基因組測序數(shù)據(jù)以及蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成的4 份蘿卜全基因組重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，開發(fā)具有廣泛通用性的蘿卜分子標(biāo)記。這些標(biāo)記通過瓊脂糖凝膠電泳即可完成基因型檢測。采用以上分子標(biāo)記對已收集的255 份蘿卜種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，構(gòu)建其相應(yīng)的分子身份證，明確不同種質(zhì)間的親緣關(guān)系。本試驗(yàn)所得標(biāo)記可用于育種材料的背景選擇、雜種鑒定等基礎(chǔ)性工作，為蘿卜種質(zhì)鑒定及分子育種工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所蘿卜團(tuán)隊(duì)收集的255 份蘿卜核心種質(zhì)，主要包括優(yōu)良地方品種自交系和育種材料等。2020 年9 月13日將上述材料播種于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜基地。每份材料6～10 株，株距25 cm，行距32 cm，常規(guī)種植管理。

1.2 DNA 提取

采用CTAB 法（Webb &Knapp，1990）提取植物基因組DNA，略加修改。每份蘿卜種質(zhì)選取6 株1 月齡幼苗，取等量葉片混合，放入2 mL 離心管；加入800 μL CTAB（1.5%，/）提取液，使用磨樣機(jī)（TissueLyser-64，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）磨樣90 s，然后65 ℃水浴30 min，期間顛倒振蕩3 次；加入600 μL 24∶1（/）的氯仿∶異戊醇，上下顛倒混勻5 min，室溫10 000 r·min離心10 min；吸取500 μL 上清液，放入新的1.5 mL 離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻50 次，室溫12 000 r·min離心15 min，棄上清液；加入1 mL 75%酒精清洗2 次，棄酒精，吸取多余液體，室溫吹干；加入200 μL ddHO，室溫溶解30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

為提高分子標(biāo)記的通用性，采用蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成的4 份蘿卜全基因組重測序數(shù)據(jù)（ENA 登記號：ERP128830）和已公布的520 份蘿卜簡化基因組測序數(shù)據(jù)（Kitashiba et al.，2020）進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)。全基因組重測序在北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司Illumina Novaseq 6000 測序平臺完成，每份樣品獲得約6 GB 數(shù)據(jù)量。采用已公布的蘿卜基因組QZ-16（ENA 登記號：PRJEB37015）為參考基因組，使用Bowtie 2（Langmead &Salzberg，2012）進(jìn)行數(shù)據(jù)比對，利用GATK 4.0 進(jìn)行插入/缺失位點(diǎn)鑒定，引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：①在520 份蘿卜簡化基因組測序數(shù)據(jù)以及4份蘿卜全基因組重測序數(shù)據(jù)中選擇含有0/0 和1/1兩種不同的基因型類別，且4 份重測序材料基因型不同；② 插入/缺失位點(diǎn)序列差異大于50 bp；③變異位點(diǎn)在所有材料中的丟失率小于0.9，等位基因頻率大于0.05，每1 Mb 選擇1 個(gè)位點(diǎn)；④ 引物設(shè)計(jì)選擇數(shù)據(jù)質(zhì)量（quality）400 以上的插入/缺失位點(diǎn)；⑤ 設(shè)計(jì)引物盡可能均勻分布于每條蘿卜染色體上?；谝陨蠘?biāo)準(zhǔn)，采用Primer3Plus（https：//primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）設(shè)計(jì)引物，一共設(shè)計(jì)了92 對分子標(biāo)記，隨機(jī)選取24 份蘿卜種質(zhì)用于分子標(biāo)記篩選。

1.4 PCR 擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR 擴(kuò) 增 采 用11 μL 反 應(yīng) 體 系：2× EsMasterMix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）5 μL，10 nmol·L正、反向引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，ddHO 3 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，50～63 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)38 次；72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，實(shí)時(shí)凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR+（Bio-Rad 公司，美國）進(jìn)行拍照。

1.5 數(shù)據(jù)賦值及分子身份證編碼

對電泳條帶進(jìn)行賦值，規(guī)則如下：①若擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，將遷移率較大的條帶賦值為0，遷移率較小的條帶賦值為1；② 同時(shí)出現(xiàn)遷移率較大和較小的雜合條帶時(shí)，重新選取6 個(gè)該樣本單株材料，分別提取DNA，重新進(jìn)行基因型鑒定，當(dāng)50%以上植株均為雜合時(shí)確定其為雜合型，賦值為2；③若出現(xiàn)缺失條帶類型時(shí)，重新提取該樣本DNA，重新進(jìn)行基因型鑒定，若結(jié)果仍為缺失帶型，賦值為X。

按照蘿卜染色體Rs1～Rs9 順序?qū)σ镞M(jìn)行排序。同一條染色體上的引物，按照物理位置大小進(jìn)行排序。依據(jù)上述賦值規(guī)則，采用24 對引物（表1）對255 份蘿卜種質(zhì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并賦值，形成原始賦值數(shù)據(jù)。最后將24 位賦值結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，完成蘿卜種質(zhì)的分子身份證構(gòu)建。

表1 構(gòu)建蘿卜分子身份證的引物信息

1.6 親緣關(guān)系分析

使用NTSYS-pc（v2.1）軟件對蘿卜種質(zhì)進(jìn)行聚類分析。將基于PCR 賦值結(jié)果建立的0，1 矩陣導(dǎo)入到軟件中，采用UPGMA 法進(jìn)行聚類，最終繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選目標(biāo)分子標(biāo)記

隨機(jī)選取24 份蘿卜種質(zhì)，對初步設(shè)計(jì)的92 個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行篩選。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，92個(gè)分子標(biāo)記中有25 個(gè)標(biāo)記含有3 種或3 種以上條帶，43 個(gè)標(biāo)記無多態(tài)性或存在較多無PCR 產(chǎn)物情況，僅24 個(gè)標(biāo)記含有2 種條帶（圖1）。最終，篩選24 個(gè)標(biāo)記為目標(biāo)分子標(biāo)記。

圖1 9 個(gè)分子標(biāo)記在部分蘿卜種質(zhì)中的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 構(gòu)建蘿卜種質(zhì)分子身份證

參照賦值標(biāo)準(zhǔn)，對255 份蘿卜種質(zhì)進(jìn)行分子身份證構(gòu)建。按照蘿卜基因組QZ-16 上染色體順序Rs1～Rs9 及其分子標(biāo)記所在物理位置進(jìn)行排序，獲得由24 位數(shù)字編碼組成的蘿卜分子身份證（表2）。

表2 255 份蘿卜種質(zhì)的分子身份證

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

參試255 份蘿卜種質(zhì)中，僅16 份材料的24 個(gè)標(biāo)記均為純合型（帶型僅為0 和1）；39 份材料在24 個(gè)SV 標(biāo)記中有1 個(gè)位點(diǎn)為雜合型（帶型為2），其余位點(diǎn)均為純合型帶型。此外，R033～R055 為商品種，采用24 個(gè)分子標(biāo)記對其進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)商品種材料的雜合位點(diǎn)數(shù)目為4～11 個(gè)，其中R045（京紅6 號）、R048（沙窩）和R051（短葉13）含有4 個(gè)雜合位點(diǎn)，是雜合等位基因較少的蘿卜商品種，推測可能是由于父母本親緣關(guān)系較近或者為多代自交所致。

1.3 蘿卜種質(zhì)聚類分析

使用NTSYS-pc（v2.1）軟件對255 份蘿卜種質(zhì)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明（圖2），在相關(guān)系數(shù)0.55 處可將參試蘿卜種質(zhì)分為4 個(gè)類群。其中，多個(gè)材料間具有較高的相似性，如R001 和R152、R107 和R125、R066 和R106 等。

圖2 基于SV 標(biāo)記的255 份蘿卜種質(zhì)聚類分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用520 份蘿卜簡化基因組測序數(shù)據(jù)和4 份蘿卜全基因組重測序數(shù)據(jù)，開發(fā)了24 個(gè)具有通用性的分子標(biāo)記，并以此構(gòu)建了參試255 份蘿卜種質(zhì)的分子身份證。同時(shí)，利用以上分子標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)，完成了255 份蘿卜種質(zhì)的親緣關(guān)系鑒定，在相關(guān)系數(shù)0.55 處將參試蘿卜種質(zhì)分為4 個(gè)類群，其中多個(gè)材料間具有較高的相似性，如R001 和R152、R107 和R125、R066 和R106 等。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)這些材料表型接近，推測以上高相似性種質(zhì)可能為不同收集來源的同種材料。該結(jié)果將為后續(xù)蘿卜核心種質(zhì)的篩選及創(chuàng)制提供技術(shù)支撐。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，蔬菜作物已完成多個(gè)分子身份證的構(gòu)建，如黃瓜（李斯更 等，2013）、菜薹（菜心）（郭培國 等，2014）、芥菜（王玉紅，2016）、大白菜（劉栓桃 等，2019）等。蘿卜的分子身份證研究起步較早，2014 年邱楊等利用SSR 標(biāo)記對75 份蘿卜種質(zhì)進(jìn)行基因分型，首次完成了蘿卜分子身份證的構(gòu)建（邱楊 等，2014）。以上研究中，多為基于SSR 標(biāo)記技術(shù)的分子身份證構(gòu)建，僅少數(shù)采用InDel 標(biāo)記技術(shù)，如黃瓜、大白菜（李斯更 等，2013；劉栓桃 等，2019）。然而，在黃瓜和大白菜的分子身份證構(gòu)建中插入/缺失序列的變異幅度較小（≈ 5 bp），須采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)技術(shù)選擇大于50 bp 的結(jié)構(gòu)變異，開發(fā)并獲得了24 個(gè)通用性的分子標(biāo)記，均采用普通瓊脂糖凝膠電泳即可完成基因分析和相關(guān)檢測?？梢姡捎靡陨戏肿訕?biāo)記對不同蘿卜種質(zhì)進(jìn)行基因分型以及背景選擇，將極大地降低蘿卜材料的分子檢測成本，同時(shí)顯著提升蘿卜分子育種的效率。此外，SSR 分子標(biāo)記具有高多態(tài)性特點(diǎn)，在1 個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性大于2 個(gè)，這對PCR 產(chǎn)物的賦值及標(biāo)準(zhǔn)化提出了挑戰(zhàn)。基于物種水平的大數(shù)據(jù)分析，可在一個(gè)物種水平上鑒定通用性的分子標(biāo)記，篩選多態(tài)性為2 個(gè)的分子標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化賦值，有利于構(gòu)建統(tǒng)一的分子身份證數(shù)據(jù)庫。

綜上所述，基于基因組水平大片段序列插入/缺失變異，本試驗(yàn)開發(fā)了僅需瓊脂糖凝膠電泳檢測的24 個(gè)通用性分子標(biāo)記，構(gòu)建了255 份蘿卜種質(zhì)的分子身份證，并完成了其親緣關(guān)系鑒定。本試驗(yàn)的開展，一方面將有利于提升蘿卜分子標(biāo)記的檢測效率及其標(biāo)準(zhǔn)化賦值水平，另一方面將為蘿卜新種質(zhì)的鑒定與背景選擇提供寶貴信息資源。