余 躍，唐 駿，肖 旻

(廈門理工學院 通信工程系，福建 廈門 361024)

0 引 言

數(shù)字PCR(Polymerase Chain Reaction)是新一代核酸檢測技術，具有高靈敏度、高特異性以及絕對定量的優(yōu)點，相較于實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)不依賴Ct值和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測[1-2]。本世紀以來，基于微納制造工藝的集成微腔室陣列芯片的數(shù)字PCR實現(xiàn)平臺在病毒檢測、癌癥標志物稀有突變檢測以及食品病毒學等領域展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢與應用前景[3-4]，準確地分割數(shù)字PCR熒光圖像微腔室對提升數(shù)字PCR檢測精度具有重要意義。然而，在獲取數(shù)字PCR熒光圖像過程中，通常會面臨感光不均勻的情況，使得從所采集的圖像中分割微腔室的難度增大。由數(shù)字PCR技術原理可知，從熒光圖像分割出的有效腔室越少，絕對定量準確度越低[5-6]。

當前，在數(shù)字PCR熒光圖像分割中常用的方法有全局自適應閾值法、局部自適應閾值法以及基于深度學習的分割算法等[7-8]。由于熒光圖像存在感光不均勻的現(xiàn)象，全局自適應閾值法和局部自適應閾值法分割準確率較低。文獻[9]根據(jù)熒光圖像直方圖的分布特點使用Otsu算法選取雙閾值進行分割，但不適用于感光不均勻的熒光圖像。為提高分割準確率，文獻[10]中在去除光照分量基礎上再使用Otsu算法分割，但其分割結果中仍存在大量有效信息丟失。近年來，隨著深度學習在圖像領域應用的日益廣泛，有學者將深度學習技術引入數(shù)字PCR熒光圖像分割：文獻[11]中將Mask R-CNN模型應用于數(shù)字PCR熒光圖像分割，通過殘差運算搭建深層次的網(wǎng)絡結構進行實例分割；文獻[12]中通過先進行微腔室精確定位再使用微腔室及其周圍腔室參數(shù)作為隨機森林分類器訓練集進行訓練，實現(xiàn)微腔室分類。然而這些算法主要針對感光均勻圖像中陽性腔室的檢測，而對感光不均勻區(qū)域較大且密集度高的數(shù)字PCR熒光圖像難以準確檢測出目標腔室，會將大量感光不均勻區(qū)域的偽陽性腔室錯判成陽性腔室。

基于上述問題，本文提出了兩步分割算法，實現(xiàn)感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的分割。該算法首先利用傳統(tǒng)Otsu算法對預處理后的圖像進行第一步分割，再使用改進后的Otsu算法進行第二步分割，結合兩步分割結果形成最終分割圖像，實現(xiàn)感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的自動分割。

1 第一步分割算法

首先將待處理圖像轉化為灰度圖像，并進行雙線性插值處理提升圖像細節(jié)表現(xiàn)力[13]。由于圖像部分區(qū)域偏暗或偏亮，利用自適應直方圖均衡化可增強圖像清晰度和對比度。為了進一步突出反應腔室的特征，采用Top-hat變換和Bottom-hat變換提高圖像對比度。

使用Top-hat變換和Bottom-hat變換分別提取圖像灰度峰值和灰度谷值部分：

That(f)=f-(f°b)，

(1)

Bhat(f)=(f·b)-f。

(2)

式(1)和式(2)中：That(f)表示灰度峰值部分，f表示自適應直方圖均衡化后的圖像，f°b表示使用結構元素b對f進行開運算；Bhat(f)表示灰度谷值部分，f·b表示使用結構元素b對f進行閉運算。之后對上述結果進行組合運算達到增強圖像對比度的效果：

I=That(f)+g-Bhat(f)。

(3)

式中：g表示雙線性插值結果，I表示對比度增強后圖像。

經(jīng)過上述處理，圖像仍存在噪聲，使用中值濾波和高斯濾波可大幅改善圖像質量[14]。

Otsu算法依據(jù)灰度直方圖確定分割閾值[15-16]，基本原理如下：設圖像灰度級數(shù)為L，灰度i出現(xiàn)的概率為h(i)，以閾值T將圖像分為背景S0(T)=[0,…,T]和前景S1(T)=[T+1,…,L-1]，背景與前景的概率分別為

(4)

(5)

則背景與前景的平均灰度值分別為

(6)

(7)

整幅圖像的平均灰度值為

μ=G0(T)μ0(T)+G1(T)μ1(T)。

(8)

于是，當閾值為T時，背景與前景的類間方差為

σ2(T)=G0(T)(μ0(T)-μ)2+G1(T)(μ1(T)-μ)2

(9)

將T遍歷灰度區(qū)間，得到σ2(T)最大時的Thre1為圖像最優(yōu)分割閾值：

(10)

使用Otsu算法進行第一步分割結果如圖1所示，可見圖中部分區(qū)域分割不完全。

圖1 第一步分割結果

2 第二步分割算法

因感光不均勻區(qū)域干擾，導致第一步分割后的圖像存在許多分割不完全區(qū)域，且這些區(qū)域的面積通常比單個腔室的面積大得多。因此，可以通過連通域面積大小來確定分割不完全區(qū)域，對其進行第二步分割，流程如圖2所示。

圖2 第二步分割流程圖

2.1 基于Otsu算法的局部閾值法

局部閾值法將圖像劃分為若干子區(qū)域，再對每個子區(qū)域分別計算最優(yōu)分割閾值，可降低非均勻感光帶來的影響。設計基于Otsu算法的局部閾值法對感光不均勻區(qū)域進行第二步分割。

首先，統(tǒng)計圖像分割不完全區(qū)域個數(shù)為n，再逐個對分割不完全區(qū)域灰度圖進行預處理，預處理包括圖像增強和圖像濾波。然后，使用Otsu算法分割后填補到原位置，待所有區(qū)域分割完成后，通過邏輯運算消除圖像灰度之間的不連貫，進而形成最終分割圖。算法流程如圖3所示。該算法可在第一步分割基礎上對部分感光不均勻區(qū)域進行分割，但算法步驟繁多、復雜度高。

圖3 局部閾值法分割流程圖

2.2 改進Otsu算法

圖像復雜度是用來反映圖像內部的復雜程度，可描述圖像進行某些處理(如圖像增強、圖像分割、圖像識別等)時內在的困難程度[17]?；趶V義集合的圖像復雜度的計算公式為

(11)

式中：C表示圖像復雜度，單位為b；t表示劃分目標區(qū)域和背景區(qū)域的分割閾值；n(k)表示灰度k的像素個數(shù)；N表示圖像像素總數(shù)。

廣義集合中元素具有互異性、無序性以及確定性的特點，可知影響圖像復雜度的因素是圖像灰度級數(shù)量和其出現(xiàn)的頻次，而與灰度本身大小無關。圖像復雜度是圖像的一種客觀屬性，由其性質可知，圖像整體復雜度大于等于各部分復雜度之和[18]，故圖像灰度級數(shù)量與其出現(xiàn)頻次的變化會影響圖像復雜度大小。由傳統(tǒng)Otsu算法原理可知，當圖像暗像素過多時會拉低分割閾值，亮像素過多時會拉高分割閾值[19]。因此，在確定分割閾值前，利用圖像復雜度的性質確定待分割區(qū)域的大致灰度范圍，減少較低和較高灰度對分割閾值確定的影響，再基于該灰度范圍內灰度統(tǒng)計信息計算最優(yōu)分割閾值。這樣克服了傳統(tǒng)Otsu算法需要統(tǒng)計所有灰度信息再計算分割閾值的缺點，閾值的選取會更加快速準確，且分割效果更好。

假設待分割圖像f(x,y)總像素數(shù)為N0，灰度級數(shù)為L，灰度值為k的像素數(shù)為n(k)，利用公式(11)計算全局圖像復雜度為

(12)

圖像最小灰度值和最大灰度值分別記做Zmin和Zmax。由于待分割圖像為第一步分割不完全區(qū)域，待分割區(qū)域灰度范圍最小值和最大值應位于閾值Thre1兩側，故令初始閾值T0為Thre1。以迭代步長為1的速度同時縮減圖像灰度區(qū)間兩端灰度值，縮減后最小灰度值和最大灰度值分別為α和β。設灰度區(qū)間(α,T0)和(T0+1,β)的像素總數(shù)分別為N1和N2，則兩區(qū)間內圖像復雜度C1和C2分別為

(13)

(14)

灰度區(qū)間(α,T0)和(T0+1,β)內像素總數(shù)占灰度區(qū)間(α,β)內像素總數(shù)的比例分別為r1和r2：

(15)

(16)

則灰度區(qū)間(α,β)的平均復雜度為

(17)

假設存在任意大于0的數(shù)ε，當最小灰度值為α、最大灰度值為β時滿足迭代條件

(18)

α和β的取值范圍分別為

Zmin≤α

式(18)中：ΔC表示灰度縮減前后圖像復雜度的變化量；ε用于控制灰度縮減程度，ε越大，表示待分割區(qū)域灰度范圍越小。ε的數(shù)值可根據(jù)圖像感光不均勻程度確定。經(jīng)仿真驗證，針對數(shù)字PCR熒光圖像感光不均勻區(qū)域的分割，ε取0.5C0時計算的分割閾值更準確。

通過上述算法確定最終待分割區(qū)域的灰度范圍為(α,β)，統(tǒng)計該范圍灰度信息，尋找使該范圍的類間方差最大的閾值Thre2，再利用Thre2對圖像進行分割：

(19)

最后通過邏輯運算將第一步分割結果與f*(x,y)合并，形成最終分割圖像。

3 實驗結果與分析

為驗證本文算法的有效性，對感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像進行了仿真實驗。實驗平臺是Intel(R)Core(TM)i5-8265U CPU @ 1.60 GHz，編程環(huán)境為Matlab R2020a。圖1(a)是一幅數(shù)字PCR熒光圖像局部，可以看出該圖中含有感光不均勻區(qū)域。圖4(a)描述的是熒光圖像第1 360列的第1 220～1 500行灰度在對比度增強前后的波動曲線，分析可知，圖像對比度增強后波動曲線的波峰與波谷之間灰度差值增加，達到了圖像對比度增強的效果。圖4(b)是預處理后的圖像，可以看出預處理不僅改善了圖像灰度分布的均勻性，而且使腔室特征更加明顯。提取第一步分割不完全區(qū)域使用局部閾值法進行第二步分割結果如圖4(c)所示，該法雖然分割了該圖的微腔室，但耗時較長，魯棒性不好，算法復雜度高。

圖4 預處理及局部閾值法分割結果

使用本文改進的Otsu算法進行第二步分割，并選擇傳統(tǒng)Otsu算法、自適應閾值法以及分塊閾值法同時進行對比實驗。圖5(a)是第一步分割不完全區(qū)域灰度圖，可以看出該圖對比度低且灰度像素分布不均勻。經(jīng)預處理后使用傳統(tǒng)Otsu算法分割結果如圖5(b)所示，由于圖像低灰度像素過多，嚴重拉低了分割閾值，導致待分割區(qū)域中央丟失了若干目標。圖5(c)是自適應閾值法分割結果，待分割區(qū)域邊緣受到低灰度像素的干擾，幾乎分割不出腔室的形狀，而在其他區(qū)域也存在嚴重的噪聲干擾，腔室之間粘連嚴重。圖5(d)是分塊閾值法分割結果，由于分塊大小固定，受灰度分布不均勻的影響，分割后的圖像不連貫。圖5(e)為本文改進的Otsu算法分割結果，該法消除了過高與過低灰度的影響，腔室被準確分割出來，且邊緣也未受到低灰度像素的干擾。圖5(f)是使用改進的Otsu算法進行第二步分割并與第一步分割結果合并形成的最終分割圖，可見本文的兩步分割算法有效分割了光照不均勻熒光圖像的目標腔室，分割后的圖像自然連貫，腔室邊緣清晰完整，反映了腔室的實際情況。

圖5 第二步分割結果

為進一步驗證本文算法的有效性，又對另外四幅感光不均勻熒光圖像進行了分割，從圖6分割結果看出，傳統(tǒng)Otsu算法和自適應閾值法分割結果粘粘嚴重，無法分割出目標腔室；分塊閾值法分割后的圖像塊與塊之間連接不自然，甚至部分區(qū)域有效信息丟失；局部閾值法對原圖5的分割結果中部分腔室未能準確分割；而本文算法對幾幅圖像都進行了準確分割，所分割的目標腔室輪廓清晰，包含腔室質心，為熒光信號提取提供了保障，從而也驗證了本文算法的有效性。表1為Otsu算法改進前后閾值對比，可以看出改進后Otsu算法分割閾值高于傳統(tǒng)Otsu算法分割閾值。由于第二步分割對象主要是感光不均勻區(qū)域，其閾值會高于第一步分割閾值，符合待分割圖像實際情況。

圖6 分割算法實驗結果對比圖

表1 Otsu算法改進前后閾值對比

為測試改進的Otsu算法分割速度，使用不同算法對五幅圖像第二步分割耗時進行比較，各算法耗時如表2所示。由表中數(shù)據(jù)可知，本文改進的Otsu算法分割耗時低于其他算法，與局部閾值法相比，不僅提升了分割效果，降低了算法復雜度，也提高了算法的運行速度。

表2 五種分割算法耗時對比

為對各算法分割結果進行定量評估，本文選用人工手動分割結果作為標準二值掩碼(Ground truth,GT)進行誤分類誤差(Misclassification Error,ME)計算[20]。ME值可對各算法分割性能進行客觀評價，ME值越低表示算法分割性能越好，其數(shù)值定義為

(20)

式中：B0和F0表示標準二值掩碼中的背景和前景，BT和FT表示分割結果中的背景和前景，|·|表示取集合元素總數(shù)。表3給出了幾種算法分割結果的ME值，由表中數(shù)據(jù)分析可知，自適應閾值法分割誤差最大，本文所提兩步分割算法分割誤差最小且分割效果更好。

表3 五種分割算法ME值對比

4 結束語

為了解決感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像分割準確率低的問題，本文提出了一種兩步分割算法。第一步分割使用傳統(tǒng)Otsu算法，第二步分割使用改進的Otsu算法。其中，在第二步分割中改進了傳統(tǒng)Otsu算法需要統(tǒng)計所有灰度級信息再計算閾值的缺點，通過先確定待分割區(qū)域的閾值范圍，然后基于該范圍的灰度統(tǒng)計信息計算分割閾值，提升了閾值選取的準確性，且分割效果更理想，實現(xiàn)了感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的分割。本文算法與局部閾值法、自適應閾值法以及分塊閾值法的對比結果表明，本文算法魯棒性好、復雜度低，可以實現(xiàn)不同程度感光不均勻數(shù)字PCR熒光圖像的分割，分割結果準確反映了腔室的實際情況。這一研究可用于芯片式數(shù)字PCR芯片閱讀儀的分析軟件中，解決目前數(shù)字PCR熒光圖像處理速度慢準確率低等問題。本文算法也可拓展應用到其他存在感光不均勻圖像的分割中，具有一定的借鑒意義。但從整體算法流程可知，本文算法需經(jīng)兩步分割完成整幅圖像的分割，接下來將繼續(xù)對圖像進行算法研究，進一步簡化分割算法流程。