李鴻昊，許鳴,，韓美霞，鄧媛媛，黎麗旋,

【提要】目的 分析基底膜(BM)相關(guān)基因在胃癌中的表達(dá)意義。方法 從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載BM相關(guān)基因、胃癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床信息；基于TCGA篩選BM差異基因后進(jìn)行COX和Lasso回歸分析構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存預(yù)后以及臨床特征之間的關(guān)系， GSE26253隊(duì)列驗(yàn)證其預(yù)測(cè)生存預(yù)后的準(zhǔn)確性。功能富集、GSVA分析風(fēng)險(xiǎn)基因潛在的作用通路。計(jì)算免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的關(guān)系，基于風(fēng)險(xiǎn)基因模型發(fā)掘胃癌相關(guān)的免疫檢查點(diǎn)。結(jié)果 基底膜相關(guān)基因高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是胃癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；風(fēng)險(xiǎn)基因與免疫功能密切相關(guān)(P<0.05); 風(fēng)險(xiǎn)基因相關(guān)的免疫檢查點(diǎn)及相關(guān)通路存在關(guān)聯(lián)(P<0.05)。結(jié)論 基底膜相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因模型在胃癌中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

據(jù)最新調(diào)查顯示，胃癌的發(fā)生率和死亡率均位列于所有腫瘤類型的前列[1-2]。近些年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的基因在胃癌中的表達(dá)作用被逐漸挖掘[3]。多數(shù)胃癌患者在被診斷時(shí)已處于中晚期階段，預(yù)后較差。因此，積極探索與胃癌相關(guān)的潛在預(yù)測(cè)及預(yù)后基因具有重要的價(jià)值[4-5]?；啄?(BM) 是最古老的動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)，其周圍圍繞大多數(shù)組織和上皮細(xì)胞，形成片狀結(jié)構(gòu)。其中包含層粘連蛋白和膠原分子，對(duì)于細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移起到至關(guān)重要的作用[6]。研究表明BM相關(guān)基因與腫瘤細(xì)胞脫落、轉(zhuǎn)移存在緊密關(guān)聯(lián)因此，理解BM相關(guān)基因在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中具有重要意義[7]。

本次研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)掘，首次從BASE數(shù)據(jù)庫(kù)中下載BM相關(guān)基因[8]，研究其在胃癌中的表達(dá)意義。首先篩選在胃癌中差異倍數(shù)較大的BM相關(guān)基因，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型?；陲L(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，從而評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)模型在胃癌中的臨床應(yīng)用。同時(shí)采用基因功能富集分析其在生物學(xué)功能方面的應(yīng)用，以及探討風(fēng)險(xiǎn)模型與胃癌免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系，發(fā)掘潛在的免疫檢查點(diǎn)，旨在臨床方面為胃癌的治療尋求新的思路。

1 材料與方法

1.1 使用數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站

TCGA(https://www.cancer.gov/)；BASE (https://bmbase.manchester.ac.uk)；GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)；MSigDB(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb)；GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)；KM-plot(http://kmplot.com/analysis/)。

1.2 數(shù)據(jù)下載

從TCGA官網(wǎng)STAD-counts平臺(tái)下載胃癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床信息。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE26253芯片數(shù)據(jù)。從BASE數(shù)據(jù)庫(kù)中下載BM相關(guān)基因。

1.3 篩選基底膜相關(guān)差異基因

基于TCGA隊(duì)列基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用R中l(wèi)imma包進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，篩選BM相關(guān)差異基因。設(shè)置條件為|LogFC|>2，矯正后的P值FDR<0.05。使用R對(duì)差異基因進(jìn)行單因素COX回歸預(yù)測(cè)，對(duì)具有預(yù)后價(jià)值的差異基因進(jìn)行LASSO-Cox回歸分析構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型。

1.4 建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型

基于上述差異基因，采用 R 軟件 glmnet包進(jìn)行 LASSO-Cox回歸分析，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型。風(fēng)險(xiǎn)模型通過(guò)以下公式計(jì)算：風(fēng)險(xiǎn)模型=(系數(shù)1 * mRNA1基因表達(dá)量) + (系數(shù)2 * 基因表達(dá)量 mRNA2) + (系數(shù)n * mRNAn基因表達(dá)量)。 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)模型表達(dá)公式，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)胃癌病人進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，繪制Kaplan-Meier生存曲線。此外，分析TCGA隊(duì)列患者臨床特征與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的相關(guān)性。對(duì)GSE26253芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，得到433個(gè)胃癌術(shù)后患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間，使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型對(duì)每個(gè)胃癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.5 受試者操作特征(ROC)與列線圖

利用R中survivalROC包繪制受試者工作特征(ROC)曲線判讀風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)患者第1、3、5年生存率的敏感性和特異性，評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。PCA 分析探討高低風(fēng)險(xiǎn)組病人的分布范圍。使用臨床特征與風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建列線圖，預(yù)測(cè)胃癌患者第1-，3-，5-年的生存率，C指數(shù)與校準(zhǔn)曲線評(píng)估列線圖的準(zhǔn)確性。

1.6 基因功能富集分析與GSVA

通過(guò)R中ClusterProfiler包進(jìn)行GO分析，包括分子功能(MF)，生物學(xué)途徑(BP)，細(xì)胞組分(CC)。并使用同樣的方法計(jì)算KEGG富集通路分析。篩選條件為L(zhǎng)ogFC>1，F(xiàn)DR<0.05。GSVA進(jìn)一步探索風(fēng)險(xiǎn)基因潛在的作用通路。

1.7 免疫浸潤(rùn)與免疫檢查點(diǎn)

腫瘤的進(jìn)展與免疫浸潤(rùn)密切相關(guān)，我們對(duì)于免疫浸潤(rùn)在高低風(fēng)險(xiǎn)組的病人進(jìn)行了進(jìn)一步分析。CIBERSORT計(jì)算基于風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)分分組的高低風(fēng)險(xiǎn)組病人的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平間的差異，分析免疫功能與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的關(guān)系。另從文獻(xiàn)中整理已發(fā)表的免疫檢查點(diǎn)，用于分析風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫檢查點(diǎn)的關(guān)聯(lián)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析基于R軟件包(R 4.2.1.)計(jì)算，P<0. 05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 從BASE數(shù)據(jù)庫(kù)下載224個(gè)BM相關(guān)基因

從TCGA中下載胃癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集臨床信息(臨床信息見(jiàn)表格1)，得到375例胃癌組織及32例正常組織樣本。從GEO中下載了從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE26253芯片數(shù)據(jù)，得到433個(gè)胃癌患者組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及胃癌患者術(shù)后隨訪時(shí)間。

表1 TCGA胃癌轉(zhuǎn)錄組的臨床樣本特征

2.2 篩選BM相關(guān)差異基因

如表2所示，在TCGA隊(duì)列中，通過(guò)與正常組織做比較，在224個(gè)BM相關(guān)差異基因中，共篩選出22個(gè)差異基因(|LogFC|>2， FDR<0.05)，其中COL4A6、UNC5D、AMTN在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，19個(gè)基因在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。

表2 TCGA-STAD隊(duì)列中差異表達(dá)4倍及以上的BM相關(guān)差異基因

圖1 胃癌患者的BM相關(guān)差異基因的篩選 A：22個(gè)BM相關(guān)基因構(gòu)成的基因熱圖；B：22個(gè)BM相關(guān)基因構(gòu)成的火山圖

2.3 構(gòu)建基底膜相關(guān)基因風(fēng)險(xiǎn)模型

使用R survival對(duì)上述22個(gè)差異基因進(jìn)行單因素COX回歸預(yù)測(cè)(圖2A)，對(duì)具有預(yù)后價(jià)值的差異基因進(jìn)行LASSO-Cox回歸分析構(gòu)建了BMS-GE風(fēng)險(xiǎn)模型(圖2B和2C)：風(fēng)險(xiǎn)模型=(VCAN*0.13435+ADAMTS18*0.06122)。采用風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算公式，在TCGA-STAD隊(duì)列中，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)為臨界值，將隊(duì)列患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(n=185)和低風(fēng)險(xiǎn)組(n=186)，Kaplan-Meier曲線顯示高風(fēng)險(xiǎn)組生存時(shí)間明顯縮短(圖3A)；使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型對(duì)GSE26253隊(duì)列中樣本進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)為臨界值，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者無(wú)瘤生存期明顯低于風(fēng)險(xiǎn)組患者(圖3B)。分析風(fēng)險(xiǎn)模型與臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示：G3組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分明顯大于G2組；N3組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分大于N1組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分；StageⅡ/StageⅢ組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分均大于StageI組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分；T2/T3/T4組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分均大于T1組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，T4組評(píng)分大于T3組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(P<0.05)。

圖2 COX-LASSO回歸分析 A：COX回歸森林圖 22個(gè)基底膜相關(guān)差異基因進(jìn)行分析得到4個(gè)具有預(yù)后價(jià)值的基因；B：Lasso回歸選擇最合適的λ值，4個(gè)危險(xiǎn)基因的Lasso系數(shù)路徑圖；C：Lasso回歸交叉驗(yàn)證

圖3 風(fēng)險(xiǎn)模型與胃癌生存預(yù)后及臨床特征之間的關(guān)系 A.TCGA隊(duì)列中高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存率明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)組患者;B.GSE26253隊(duì)列中，高風(fēng)險(xiǎn)組的術(shù)后無(wú)瘤生存率明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)組患者。C：風(fēng)險(xiǎn)模型與TCGA隊(duì)列臨床特征之間的關(guān)系

2.4 ROC 曲線和PCA分析

繪制ROC曲線結(jié)果顯示：1年時(shí)的曲線下面積(AUC)為0.606，3年時(shí)AUC為0.608，5 年時(shí)AUC為0.773(圖 4A)。PCA分析能夠準(zhǔn)確區(qū)分高低風(fēng)險(xiǎn)組的分布范圍(圖4B)。結(jié)果提示BM相關(guān)基因風(fēng)險(xiǎn)模型在預(yù)測(cè)胃癌患者的生存預(yù)后方面具有一定價(jià)值。

圖4 ROC曲線與主成分分析 A：風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)價(jià)ROC曲線，AUC曲線下面積均大于60%；B：胃癌患者的生存時(shí)間及生存狀態(tài)；C：PCA分析能夠準(zhǔn)確區(qū)分高低風(fēng)險(xiǎn)組患者的分布

2.5 獨(dú)立預(yù)后分析

COX回歸分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否能夠成為獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。單因素結(jié)果顯示年齡、腫瘤分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為生存預(yù)后相關(guān)因素(圖5A)；多因素結(jié)果顯示年齡、 腫瘤分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素(圖5B)。

圖5 對(duì)胃癌臨床特征及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分急性COX回歸分析 A：?jiǎn)我蛩谻OX回歸森林圖;B：多因素COX回歸森林圖

2.6 構(gòu)建列線圖

基于TCGA隊(duì)列，納入多個(gè)預(yù)后因素(年齡、性別、分級(jí)、分期以及T分期、M期、N分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分)，采用風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算公式對(duì)患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，預(yù)測(cè)胃癌患者的生存率。從圖中可以看出第1年、5年的預(yù)測(cè)能力與預(yù)測(cè)曲線幾乎重合，第3年的預(yù)測(cè)能力與預(yù)測(cè)曲線略有偏差(圖6A)。校準(zhǔn)曲線評(píng)估列線圖的準(zhǔn)確性，C指數(shù)為0.681，提示列線圖具有較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)能力(圖6B)。

圖6 列線圖評(píng)估胃癌患者預(yù)后生存率 A:列線圖預(yù)測(cè)第1-，3-，5-的生存率；B:校準(zhǔn)曲線預(yù)測(cè)第1-，3-，5-的生存率

2.7 功能富集分析

GO分析顯示來(lái)自TCGA隊(duì)列風(fēng)險(xiǎn)組間的差異基因主要富集于含膠原細(xì)胞外基質(zhì)組織和細(xì)胞外部組織結(jié)構(gòu)(表3和圖7)。KEGG 途徑分析顯示DEG主要富集在Neuroactive ligand-receptor interaction(腦組織神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用通路信號(hào)通路)及PI3K-Akt signaling pathway(絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路)(表4和圖7)。

表3 GO富集分析

表4 KEGG通路富集分析

圖7 GO富集分析與KEGG富集分析預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)基因富集的相關(guān)通路 A：GO富集分析圈圖；B：GO富集分析柱狀圖； C：GO富集分析氣泡圖(BP代表生物學(xué)過(guò)程；CC代表細(xì)胞成分；MF代表分子功能 D：Kegg富集分析圈圖；E：Kegg富集分析柱狀圖；F：Kegg富集分析氣泡圖

2.8 GSVA

GSVA進(jìn)一步闡明基于風(fēng)險(xiǎn)組的特征的分子機(jī)制。在TCGA隊(duì)列中，GSVA結(jié)果顯示TGFβ信號(hào)通路、粘著斑激酶信號(hào)通路、間隙連接通路、糖胺聚糖生物合成硫酸軟骨素通路主要富集在高風(fēng)險(xiǎn)組。藥物代謝-其他酶通路、視黃醇代謝通路、抗壞血酸和醛酸代謝通路、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化通路主要富集在低風(fēng)險(xiǎn)組。

圖8 GSVA/Kegg分析結(jié)果

表5 GSVA分析結(jié)果前十條通路集合

2.9 風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系

根據(jù)CIBERSORT算法，計(jì)算高低風(fēng)險(xiǎn)組評(píng)分與免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系(圖9)。CIBERSORT結(jié)果顯示M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞在高風(fēng)險(xiǎn)組中呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)。此外我們進(jìn)一步探索了高低風(fēng)險(xiǎn)組與免疫相關(guān)功能之間的關(guān)系，趨化因子受體(CCR)在高風(fēng)險(xiǎn)中高表達(dá)，副炎癥相關(guān)反應(yīng)(Parainflammation)、T細(xì)胞抑制功能(T_cell_co-inhibition)、I型干擾素相關(guān)功能在高風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)。考慮到免疫檢查點(diǎn)的重要性，我們進(jìn)一步探索了高低風(fēng)險(xiǎn)組與免疫檢查點(diǎn)之間的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)在高風(fēng)險(xiǎn)組中，多個(gè)免疫檢查點(diǎn)呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)(ADORA2A、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD40LG、CD44、CD48、CD8、CD86、CD400、CD200、CD200R1、CD244、CD274、CD276、CTLA4、HAVCR2、ICOS、LAIR1、NRP1、PDCD1LG2、TIGIT)，其中包括TNF超家族/TNF受體超家族的多個(gè)成員(TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF4、TNFSF14、TNFSF18 TNFRSF5/CD40，TNFRSF7/CD27)。

圖9 風(fēng)險(xiǎn)基因模型與免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系 A：免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在高低風(fēng)險(xiǎn)組間的差異；B：免疫功能在高低風(fēng)險(xiǎn)組間的差異

2.10 ADAMST18在胃癌中具有一定研究?jī)r(jià)值

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)與Km-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)均提示在胃癌中ADAMST18高表達(dá)預(yù)示較差的生存預(yù)后。

圖11 A:Km-plotter數(shù)據(jù)庫(kù);B:GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)

3 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，是臨床上絕大多數(shù)腫瘤患者生存質(zhì)量較差的原因[9]。腫瘤細(xì)胞脫落侵入基質(zhì)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離涉及多種復(fù)雜基質(zhì)，多項(xiàng)研究表明基底膜在腫瘤細(xì)胞脫落過(guò)程中充當(dāng)十分重要的介質(zhì)[10-11]。胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤類型之一，預(yù)后較差。因此我們對(duì)基底膜相關(guān)基因在胃癌中的表達(dá)意義做出研究。

基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究，我們首次采用COX回歸及Lasso回歸分析方法成功構(gòu)建了包含VCAN、ADAMTS18兩種基底膜相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)模型。使用GSE26253隊(duì)列中患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分驗(yàn)證，得出高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)示較差預(yù)后生存。構(gòu)建列線圖及ROC曲線發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)模型可以成為胃癌的獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素且可以預(yù)測(cè)胃癌患者的生存期，此外風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與胃癌的分期、分級(jí)等臨床特征之間相關(guān)，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

研究表明VCAN在消化系統(tǒng)腫瘤中具有重要的表達(dá)意義，其與TGF-β信號(hào)通路、EMT通路等相互作用，參與腫瘤細(xì)胞的血管生成、免疫抑制等多種生物學(xué)功能從而促進(jìn)腫瘤的遷移與轉(zhuǎn)移，在胃癌中的研究也相對(duì)較多，同時(shí)有研究表明VCAN可作為胃癌的潛在治療靶點(diǎn)[12-14]。據(jù)報(bào)道，ADAMTS是一類具有鋅離子依賴性的分泌型基質(zhì)金屬蛋白酶，其家族成員在不同類型腫瘤的形成過(guò)程包括腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用以及與部分重要的癌癥相關(guān)的信號(hào)通路之間存在緊密關(guān)聯(lián)，ADAMTS18在食管癌、肝癌、肺癌、腎癌等均具有表達(dá)意義，但在胃癌中的研究報(bào)道相對(duì)較少[15-16]。我們使用KM-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)初步探索了單基ADAMTS18在胃癌方面的生存預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)ADAMTS18高表達(dá)提示較差的胃癌生存預(yù)后，由此可見(jiàn)ADAMTS18在胃癌中具有潛在的研究?jī)r(jià)值，值得進(jìn)一步探討。

進(jìn)一步研究風(fēng)險(xiǎn)基因模型在生物功能學(xué)方面的作用時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)基因主要富集于含膠原細(xì)胞外基質(zhì)組織和細(xì)胞外部組織結(jié)構(gòu)。GSVA顯示TGF/β通路、粘著斑激酶信號(hào)通路、縫隙連接通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展，以上通路均與腫瘤細(xì)胞的脫落、侵襲與遷移緊密關(guān)聯(lián)[17-18]。KEGG 途徑分析顯示風(fēng)險(xiǎn)基因主要富集在腦組織神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用通路及PI3K-Akt信號(hào)通路。EMT過(guò)程作為腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，是腫瘤加速進(jìn)程的重要中間過(guò)程。研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路參與多種類型腫瘤的發(fā)展，其是EMT過(guò)程中的重要介質(zhì)，腫瘤上皮細(xì)胞經(jīng)歷EMT過(guò)程后，細(xì)胞間的粘附能力下降、侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞隨血液循環(huán)運(yùn)動(dòng)，加速腫瘤向全身轉(zhuǎn)移[19-20]。腫瘤細(xì)胞、微環(huán)境與宿主在動(dòng)態(tài)演變中相互聯(lián)系、相互促進(jìn)，加快腫瘤的發(fā)展。在這一過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)充當(dāng)重要角色，腫瘤的運(yùn)動(dòng)侵襲性、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的能力以及在侵襲組織中定植生長(zhǎng)均與基質(zhì)相互關(guān)聯(lián)，降解細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必經(jīng)階段[21]。按分布部位來(lái)說(shuō)，基底膜屬細(xì)胞外基質(zhì)的一部分。通過(guò)以上的分析，因此我們理論上認(rèn)為基底膜相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因或許通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)的行為功能而影響腫瘤微環(huán)境的變化促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。此外，我們發(fā)現(xiàn)了腦組織神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用通路在胃癌中有所涉及，而腦組織神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用通路多在神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中報(bào)道，在胃癌中少有報(bào)道[22-23]。早有研究報(bào)道胃部出現(xiàn)異常神經(jīng)可導(dǎo)致胃癌的形成[24]，由此可見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)與胃癌的發(fā)生具有一定關(guān)聯(lián)，腦組織神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮重要作用，那么該通路是否在胃癌的發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用值得日后進(jìn)一步研究。

免疫微環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境有機(jī)整體的主要組成成分，是腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，同樣在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞在高風(fēng)險(xiǎn)組中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，已知巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞的預(yù)示胃癌患者的不良預(yù)后，這可能是高風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后差的重要影響因素；在免疫功能方面，高風(fēng)險(xiǎn)組中副炎癥相關(guān)反應(yīng)(Parainflammation)、T細(xì)胞抑制功能(T_cell_co-inhibition)、II型干擾素相關(guān)功能高表達(dá)[25-26]。以上說(shuō)明風(fēng)險(xiǎn)模型在胃癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中發(fā)揮十分重要的作用。腫瘤壞死因子受體超家族 (tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF)是一類可以通過(guò)半胱氨酸富集區(qū)域 (cysteine-rich domains, CRDs)與腫瘤壞死因子超家族 (tumor necrosis factors superfamily, TNFSF)結(jié)合的細(xì)胞因子受體超家族，TNF超家族/TNF受體超家族相互作用在多種類型腫瘤中的發(fā)生進(jìn)程中發(fā)揮重要角色，其與免疫系統(tǒng)及免疫疾病的形成中也發(fā)揮重要角色[27]。當(dāng)我們探索風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫檢查點(diǎn)之間的關(guān)系時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在高風(fēng)險(xiǎn)組中，TNF超家族/TNF受體超家族的多個(gè)成員均呈現(xiàn)高表達(dá)。此外，在高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)組中，多種CD分化抗原呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，我們知道CD分化抗原多分布在一些免疫細(xì)胞上，在腫瘤進(jìn)程中通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)成分而改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如 CD27作為腫瘤壞死因子受體超家族一員，表達(dá)在T 細(xì)胞、髓質(zhì)胸腺細(xì)胞、B 細(xì)胞亞群和自然殺傷細(xì)胞，共刺激 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞激活，從而發(fā)揮重要的免疫功能[28]。因此我們推測(cè)風(fēng)險(xiǎn)模型可與TNF超家族/TNF受體或CD分化抗原存在某種關(guān)聯(lián)，共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，基于數(shù)據(jù)庫(kù)建立的基底膜相關(guān)基因風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)胃癌的生存預(yù)后以及其與臨床特征之間的關(guān)系具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。在生物功能學(xué)方面，通過(guò)以上結(jié)果分析，我們推測(cè)，基底膜風(fēng)險(xiǎn)基因或許可通過(guò)與多條通路相互作用調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的變化而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。最后我們發(fā)現(xiàn)基底膜風(fēng)險(xiǎn)基因與胃癌的多個(gè)免疫檢查點(diǎn)相互作用，尤其與CD分化抗原與TNF超家族/TNF受體超家族緊密關(guān)聯(lián)，而CD分化抗原與TNF家族均是免疫系統(tǒng)的重要組成成分，基底膜風(fēng)險(xiǎn)基因是否是免疫系統(tǒng)的重要組成成分有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。腦組織神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用通路與ADAMTS18在胃癌領(lǐng)域具有潛在的研究?jī)r(jià)值。但本文的不足之處在于本研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，生物功能學(xué)分析多是基于已有文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行分析，缺乏一定的實(shí)驗(yàn)支撐及機(jī)制探索，我們擬在未來(lái)會(huì)在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。