張林，張浪，周劍光，甘金華，張濤，何力

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，湖北 武漢 430072)

草魚(Ctenopharyngodonidella)是鯉科、草魚屬魚類。草魚是典型的草食性魚類，棲息于平原地區(qū)的江河湖泊，一般喜居于水的中下層和近岸多水草區(qū)域。性活潑，游泳迅速，常成群覓食。草魚幼魚期則食幼蟲、藻類等，草魚也吃一些葷食，如蚯蚓、蜻蜓等。分布廣，在中國分布于黑龍江至云南元江(西藏、新疆地區(qū)除外)。已移殖到歐、美、非等各洲，是世界上廣泛養(yǎng)殖，且產(chǎn)量最高、最重要的淡水經(jīng)濟魚類之一[1]。草魚也是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，其和鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、青魚(Mylopharyngodonpiceus)一起，構(gòu)成了中國的“四大家魚”。然而，草魚容易被病原體感染，如呼腸孤病毒(Reovirus)感染，一旦感染，發(fā)病率和死亡率極高[2]。干擾素(Interferon，IFN)是一種重要的細(xì)胞因子，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌及免疫調(diào)節(jié)等多種作用[3]。作為干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulator factors, IRF)活化所必須的磷酸激酶，TNF受體相關(guān)因子(TNF Receptor-associated factor, TRAF)家族成員相關(guān)的NF-kB活化因子(TANK)結(jié)合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)，在Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)、RIG-I樣受體(RIG-I Like Receptors, RLRs)以及胞漿DNA受體介導(dǎo)的抗感染天然免疫中發(fā)揮核心樞紐作用，TBK1活化后可誘導(dǎo)下游的IFN調(diào)節(jié)因子 3/7(IRF3/7)活化并激活I(lǐng)型干擾素的表達(dá)，啟動后續(xù)信號傳導(dǎo)，抵御病原體浸染[4-5]。開展動物干擾素的研究，建立動物干擾素功能相關(guān)基因檢測方法，特別是反應(yīng)機體天然抗病免疫功能的TBK1基因的準(zhǔn)確定量檢測，可用于動物病原體感染、機體免疫系統(tǒng)激活的早期監(jiān)測，對于動物疫病的防控起到重要作用。

目前，關(guān)于基因檢測方法有RT-PCR[6]、Northern blot[7]、Real-time PCR[8-9]、融合熒光蛋白[10-11]、報告基因等[12-13]。其中qRT-PCR在養(yǎng)殖動物基因或微生物中應(yīng)用廣泛[14-15]，特別在評價機體基因表達(dá)水平的qRT-PCR方法，由于其敏感性和特異性強，能準(zhǔn)確檢測微量mRNA水平，應(yīng)用更為廣泛。但由于RNA存在質(zhì)量及反轉(zhuǎn)率效率差異等問題，一般選擇基因序列高度保守、mRNA表達(dá)數(shù)量高、穩(wěn)定表達(dá)于不同組織細(xì)胞中的18SrRNA作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[16]。

目前關(guān)于TBK1[17-18]的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，在人和雞的天然抗病免疫中已有報道[19]，然而TBK1在硬骨魚中研究較少。草魚TBK1基因研究報道很少，主要是克隆及免疫調(diào)控方面研究[19-20]，其定量檢測方法未見報道。因此本研究以草魚的18SrRNA作為內(nèi)參基因，建立了草魚TBK1的實時定量PCR檢測方法，為研究草魚病原體感染后天然抗病免疫功能的激活、草魚疫病感染的早期檢測及草魚TBK1基因的動態(tài)變化規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

本研究中實驗動物草魚(體重40～50 g，體長15.28～16.20 cm)來自長江水產(chǎn)研究所梁子湖實驗基地。

本研究所用試劑主要包括：Trizol(Invitrogen 公司)，異丙醇、三氯甲烷、無水乙醇(國藥集團)，Taq DNA 聚合酶、RNase 抑制劑、DNAseⅠ、dNTP、DEPC(TaKaRa生物科技有限公司)、RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas 公司)，ChamQ SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒(Vazyme公司)，Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、瓊脂糖、蛋白胨、酵母浸粉、TAE 緩沖液、核酸染料、DNA Maker、Plasmid Mini Kit(Tiangen公司)，pMD18T 載體、DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

本研究所用的儀器設(shè)備主要包括：PCR 基因擴增儀、CFX96 熒光定量 PCR 儀、凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad 公司)，臺式高速離心機、可調(diào)式微量移液器(2.0 μL、10.0 μL、100.0 μL)(Eppendorf公司)，DYCP-31型水平電泳儀、渦旋混合儀、HZP 型振蕩培養(yǎng)箱(北京六一)，超凈工作臺，通風(fēng)櫥、常規(guī)冰箱、超低溫冰箱(Thermo Fisher 公司)。

1.2 引物的設(shè)計與合成

通過Prime 6.0軟件，以National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫中公布的草魚TBK1序列為模板，設(shè)計2對草魚TBK1基因PCR檢測引物，以草魚的18SrRNA作為實時定量PCR的內(nèi)參基因，所設(shè)計的引物由上海生工股份有限公司合成，引物序列信息見表1。

1.3 PCR擴增及ciTBK1引物驗證

將所取的草魚腎臟、脾臟組織用液氮低溫研磨處理，利用Trizol 等試劑采用經(jīng)典的方法提取RNA，用RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴增，獲得cDNA，作為后續(xù)PCR擴增的模板，利用表1中的引物，進(jìn)行特異性PCR擴增，獲得目的基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，并回收鑒定正確的基因片段進(jìn)行測序分析，驗證所設(shè)計引物的準(zhǔn)確性。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

凝膠回收測序驗證正確的草魚TBK1及18SrRNA基因片段，與 pMD18T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐抗性篩選，選取2～3個單克隆接種含氨芐的液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性質(zhì)粒，并將所提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序正確含有目的基因的重組陽性質(zhì)粒命名為pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA，該陽性質(zhì)?？勺鳛楹罄m(xù)熒光定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 定量PCR檢測方法的建立

1.5.1 定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

以反轉(zhuǎn)錄獲得的草魚cDNA作為模板，按照熒光定量PCR試劑盒說明書推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增，以每個反應(yīng)中熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值來評判擴增效果。以熔解曲線峰單一、無非特異性擴增和Ct值最小為標(biāo)準(zhǔn)，對模板濃度、引物濃度、退火溫度、反應(yīng)時間及循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定PCR反應(yīng)最優(yōu)條件。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

測定pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及純度，換算方法參考Li等[17]建立的TBK1突變檢測的方法。將制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，以101～106拷貝/μL的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行PCR擴增，每個樣品設(shè)置3個平行，同時設(shè)置以去離子水為模板的空白對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以模板數(shù)的對數(shù)為x軸，循環(huán)數(shù)Ct值為y軸，建立定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 定量PCR反應(yīng)的敏感性、特異性及重復(fù)性驗證

用優(yōu)化建立的qRT-PCR方法擴增ciTBK1基因，通過qRT-PCR熔解曲線中擴增曲線峰單一且無雜峰來表明設(shè)計的引物特異性較強，反應(yīng)條件恰當(dāng)，以此確定qRT-PCR擴增反應(yīng)的特異性。以10倍倍比稀釋的101～106拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行qRT-PCR和常規(guī)PCR擴增，比較2種方法能夠檢出的最低模板濃度，評價定量PCR方法的靈敏性。選取1×102、1×104、1×106拷貝/μL 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行PCR擴增，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性檢驗，同時在3個不同時間點進(jìn)行組間重復(fù)性檢驗。計算定量PCR反應(yīng)Ct值的平均數(shù)和變異系數(shù)，評價定量PCR反應(yīng)的重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 ciTBK1定量PCR引物的確定

本試驗針對草魚TBK1基因所設(shè)計的2對引物均可擴增得到大小與預(yù)期相符的目的基因條帶(圖1)，且擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)與已報道的草魚TBK1基因序列一致。其中引物1進(jìn)行PCR反應(yīng)，所擴增條帶特異性更好，因此本研究選取引物1作為后續(xù)定量PCR檢測引物。

圖1 不同引物擴增ciTBK1及18S rRNA的PCR擴增基因條帶1：ciTBK1(引物1擴增)；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；2：ciTBK1(引物2擴增)；3：18S rRNA。Fig.1PCR amplification of ciTBK1 and 18S rRNANote:1:ciTBK1(primer 1 amplification);M:DNA standard DL200;2:ciTBK1(primer 2 amplification);3:18S rRNA.

2.2 定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取測序驗證正確的陽性克隆質(zhì)粒pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA，并測定其濃度，作為后續(xù)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ亟M陽性質(zhì)粒pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA的拷貝數(shù)分別為5.40×107拷貝/μL和1.28×108拷貝/μL。

2.3 定量PCR反應(yīng)條件的確定

通過對引物濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)等定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，最終確定20 μL PCR反應(yīng)體系如下：模板2 μL， 上、下游引物(2 μmol/L)各1 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，1 min；95 ℃，10 s;60 ℃，30 s;共40個循環(huán)。

2.4 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

從PCR反應(yīng)的擴增曲線分析：ciTBK1和18SrRNA的定量PCR擴增曲線間距均勻，熔解曲線單一無雜峰。根據(jù)濃度對數(shù)值與Ct值之間的關(guān)系，確定ciTBK1和18SrRNA表達(dá)量的回歸方程分別為：

2.5 特異性、敏感性及重復(fù)性試驗

特異性試驗表明：在相同的反應(yīng)條件下，以pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18SrRNA質(zhì)粒為模板能擴增到正常曲線和特征性熔解曲線峰，ciTBK1和18SrRNA擴增反應(yīng)的退火溫度Tm值分別為(80.0±0.2) ℃ 和 (82.0±0.2) ℃，PCR反應(yīng)無非特異性擴增，擴增產(chǎn)物單一(圖2)。

圖2 ciTBK1及18S rRNA熒光定量PCR擴增的特異性試驗注：圖中 a、b峰型分別代表pMD18T-ciTBK1和pMD18T-18S rRNA.Fig.2Specificity assay of qRT-PCR for detection of ciTBK1 and 18S rRNANote:a:pMD18T-ciTBK1,b:pMD18T-18S rRNA.

敏感性試驗表明：以101～106拷貝/μL的pMD18T-ciTBK1質(zhì)粒為模板進(jìn)行檢測，普通PCR反應(yīng)檢測下限為103拷貝/μL(圖3a)，而熒光定量PCR反應(yīng)檢測的下限為101拷貝/μL (圖3b)，熒光定量PCR反應(yīng)檢測下限明顯高于普通PCR反應(yīng)，靈敏度較常規(guī)PCR高100倍。

圖3 ciTBK1檢測的敏感性試驗注：3a:ciTBK1熒光定量PCR檢測的敏感性試驗；3b:ciTBK1普通PCR檢測的敏感性試驗。Fig.3Sensitivity assay for detection of ciTBK1Note:3a: Sensitivity assay of qRT-PCR for detection of ciTBK1；3b: Sensitivity assay of ordinary-PCR for detection of ciTBK1.

以3個稀釋度的重組質(zhì)粒為模板分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗，由表2可知，組內(nèi)及組間重復(fù)的變異系數(shù)分別為0.25%～0.59%、0.37%～0.49%，所建立的定量PCR檢測方法重復(fù)性好。

表2 ciTBK1熒光定量PCR擴增重復(fù)性試驗Tab.2 Repeatability assay of qRT-PCR for detection of ciTBK1

3 結(jié)論

本研究建立的草魚TBK1基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒，該產(chǎn)品中含有 SYBR Green I熒光染料，通過SYBR Green I與dsDNA非特異性結(jié)合，實時監(jiān)測隨著PCR擴增產(chǎn)物的增加熒光強度的變化情況，并通過熔解曲線排除非特異性干擾[14]。

本研究建立的熒光定量PCR檢測方法具有檢測成本低、檢測方法簡單快捷的特點。整個PCR檢測過程可實時監(jiān)測，自動化程度較高，避免了交叉污染的可能，可進(jìn)行直觀的定量分析。本研究結(jié)果表明，目的基因和內(nèi)參基因的擴增曲線間距均勻，特異性強，熔解曲線單一無雜峰，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好；同時檢測下限可達(dá)50 拷貝/μL，檢測方法的敏感性高，是常規(guī)PCR的100倍；所建立的檢測方法組內(nèi)和組間變異系數(shù)均在0.6%以內(nèi)，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

綜上所述，本研究建立的草魚TBK1基因的實時熒光定量PCR檢測方法可實現(xiàn)對草魚TBK1表達(dá)水平快速定量檢測；本檢測方法通過18SrRNA內(nèi)參基因的校正，可消除采樣、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄等過程中的操作誤差，且具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好和操作簡便等諸多優(yōu)點，可作為一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的草魚體內(nèi)TBK1基因表達(dá)監(jiān)測的有效方法，應(yīng)用于實際生產(chǎn)中草魚感染的早期監(jiān)測，為草魚疫病防治提供技術(shù)支持。