顧亞琴 陳 磊 吳紅雁 （江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院，鹽城 210042）

1 腸道微生物群

微生物幾乎覆蓋所有宿主的黏膜表面，定植在不同的身體壁龕，包括胃腸道、皮膚、口腔、泌尿生殖道和呼吸道，這些微生物統(tǒng)稱為微生物群落，主要由細菌、真菌、病毒、原生動物和古菌組成，是復雜、廣泛、動態(tài)的［1-2］。腸道是人體最大的消化和排泄器官，在腸道中寄生著約數(shù)百億種微生物，是人體最大的微生物室［3-4］。

目前，微生物分析主要依賴于無創(chuàng)且容易獲得的糞便樣品，但糞便剖面不能代表宿主體內(nèi)發(fā)生的完整情況，也不能解釋腸道微生物區(qū)系的空間異質(zhì)性。在腸道系統(tǒng)中，細菌種類和群落在整個管腔內(nèi)分布不均，細菌的密度和多樣性沿腸道縱軸增加［5-6］。通常，小腸中以快速生長的兼性厭氧菌為主，而盲腸和結(jié)腸則更利于糖溶厭氧菌生長。同時，黏液層也為宿主體內(nèi)很大一部分細菌提供了棲息地［7］。越來越多的證據(jù)表明，高度多樣化的微生物有助于維持黏膜屏障健康，反之亦然［8-9］。黏膜相關(guān)微生物群與宿主天然免疫系統(tǒng)間的相互作用值得關(guān)注，可以作為糞便群落研究的補充。

2 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體

宿主免疫系統(tǒng)與腸道微生物間的通訊通過表達于免疫細胞上或免疫細胞內(nèi)的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）的作用進行。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding and leucine-rich repeat-containing receptors，NLRs）是一類細胞質(zhì)內(nèi)PRRs，可通過調(diào)控一系列信號級聯(lián)反應參與機體的獲得性免疫和固有免疫應答過程，可與病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式直接結(jié)合，啟動天然免疫應答［10-11］。在共生微生物和宿主免疫系統(tǒng)間的通訊中，NLR 蛋白是PRRs 的重要成員之一。

NLRs是一種高度保守的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，在人類基因組中有20 多個已鑒定的NLRs 家族成員，這些蛋白均由中央核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域、C 末端亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域和N 末端效應結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。根據(jù)N末端結(jié)構(gòu)域的不同，目前一般將NLRs 分為5 個亞族［12］：①含酸性反式激活結(jié)構(gòu)域的NLRA：NLRA 亞族只有1 個成員，即Ⅱ類主要組織相容性復合物反式激活因子（class Ⅱmajor histocompatibility com‐plex transactivator，CⅡTA），負責將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞核，是MHC Ⅱ類分子（major histocompatibility complex class Ⅱmolecule）轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)劑；②含桿狀病毒抑制劑重復結(jié)構(gòu)域的NLRB：NAIP是NLRB亞族的唯一成員，是一種抗凋亡蛋白；③含半胱天冬氨酸蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的NLRC：由NOD1、NOD2、NLRC4 3 個成員組成，是微生物入侵及免疫系統(tǒng)的監(jiān)測器，主要通過激活或抑制信號通路影響細胞因子分泌；④含pyrin（pyrin domain，PYD）結(jié)構(gòu)域的NLRP：由NLRP1、NLRP3、NLRP6 等14 個成員組成，介導凋亡和炎癥信號傳導；⑤NLRX 亞族成員NLRC3、NLRC5 和NLRX1 的N 末端包含1 個未知結(jié)構(gòu)域，參與自噬的起始，并調(diào)節(jié)炎癥反應和Ⅰ型IFN信號通路傳導。

與其他PRRs 相同，NLR 家族的功能是感知病原體或損傷相關(guān)的分子模式，其在PRR 中具有獨特的配體多樣性和下游效應功能。一些NLRs，如NLRP1、NLRP3、NLRC4，NAIP 等作為炎癥小體傳感器，可通過與其配體結(jié)合，誘導IL-1 和IL-18 的分泌及炎癥形式的細胞焦亡參與機體免疫調(diào)節(jié)過程［12］。NLR 蛋白的另一個主要功能是調(diào)節(jié)炎癥信號通路，包括NF-κB 和MAPK。雖然一些NLR 家族成員，如NOD1 和NOD2，可引起這些通路對刺激的激活，但還有一些NLR 蛋白，如NLRX1、NLRC3 和NLRP12則是作為炎癥通路的負調(diào)節(jié)因子，這些共同構(gòu)成了NLR 生物學的復雜性［13-14］。此外，已有研究表明NLR 蛋白與腸道微生物群間的干擾，以及這些復雜的相互作用對腸道穩(wěn)態(tài)和炎癥產(chǎn)生的巨大影響。

3 NLRs與腸道微生物群間的相互作用

3.1 NOD1/2（NLRC1/2） NOD1 和NOD2 同屬NOD 樣蛋白，具有同源性且信號通路高度相似，NOD1/2 廣泛表達于多種細胞類型，如上皮細胞、基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞。作為眾所周知的PRRs，其可識別具有較高特異性的胞漿細菌肽聚糖片段，目前研究者認為這些肽聚糖分子主要由以下幾種方式進入宿主細胞［15-18］：①胞內(nèi)病原菌感染，如弗氏志賀菌感染，這種胞內(nèi)病原菌可激活NOD 蛋白信號通路［15］；②胞外菌通過分泌系統(tǒng)將細菌肽聚糖傳遞到宿主細胞。研究顯示，幽門螺桿菌的分泌系統(tǒng)及革蘭氏陰性菌外膜囊泡可將細菌肽聚糖傳遞到宿主細胞［15-18］；③在上皮細胞中，細菌肽聚糖可通過內(nèi)吞作用進入宿主細胞；④寡肽轉(zhuǎn)運子（如PEPT1、SLC15A4）可有效攜帶肽聚糖片段進入宿主細胞質(zhì)；⑤感染細胞周圍的正常細胞內(nèi)NOD1信號通路可被間隙連接介導活化。此外，在小腸遠端，納米顆粒能夠誘捕環(huán)境中的肽聚糖或口服來源的蛋白抗原，利用上皮M 細胞進入派爾氏集合淋巴小結(jié)，將肽聚糖轉(zhuǎn)運到腸道組織中的免疫細胞，進而維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)［19］。這些進入胞質(zhì)的途徑表明NOD1 和NOD2 蛋白可能感應胞外細菌釋放的配體，包括腸道共生菌的成分。與配體結(jié)合后，NF-κB-ERKMAPK 信號被激活，進而促進各種促炎細胞因子和趨化因子表達，以及抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）和活性氧產(chǎn)生。由于NOD1/2 有助于胞漿監(jiān)測，這些蛋白質(zhì)作為宿主-微生物相互作用的重要調(diào)節(jié)因子，也可控制腸道異常炎癥的易感性。

早期研究顯示NOD1 在多種細菌感染中具有抗菌作用，但NOD1 對整個腸道微生物群落的影響不太明顯［20-22］。BOUSKRA 等［23］和GUTIERREZ 等［24］用16S核糖體RNA（rRNA）的定量PCR對NOD1缺乏小鼠的整個細菌王國進行了分析，結(jié)果表明，與WT 小鼠相比，總細菌增加了約100 倍。此外，在NOD1 缺乏的小鼠中存在不同數(shù)量的細菌，包括梭菌、擬桿菌和腸桿菌科。但這些早期實驗使用的是非同窩對照，仍需更多實驗進一步驗證這一結(jié)論。近年YU 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6 小鼠與NOD1 缺乏小鼠雜交產(chǎn)生的WT 小鼠（WT2）在氧化偶氮甲烷（azoxy‐methane，AOM）-右旋糖酐硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）-結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌（colitis-associated colon cancer，CAC）模型中的結(jié)腸腫瘤明顯多于從杰克遜實驗室購買的“純”WT 小鼠（WT1）。雖然WT1和WT2 集落均來源于同一供應商的C57BL/6 小鼠，并被安置在同一小鼠室中，但其具有不同的微生物群組成。這種微生物群的差異與糞便材料移植、隊列和交叉構(gòu)建實驗證實的不同腫瘤敏感性直接相關(guān)。這項研究不僅強調(diào)腸道微生物群通?？捎赡阁w傳播決定，還間接表明NOD1 缺乏的小鼠可能攜帶一個生物失調(diào)的微生物群，其有助于增加腫瘤易感性。

PETNICKI-OCWIEJA 等［26］發(fā)現(xiàn)，NOD2 缺乏的小鼠的回腸和糞便中攜帶的細菌數(shù)量比同窩對照組多，細菌和硬壁菌豐度增加。由于隱窩功能受損，NOD2 缺乏小鼠在回腸末端也表現(xiàn)出抗菌活性降低和機會性病原體對定植的敏感性增加。REHMAN 等［27］使用16SrRNA 基因克隆文庫測序和高通量焦測序法將NOD2對腸道微生物群的影響進行了更直接的研究，并證實NOD2 缺乏的小鼠在糞便和末端回腸樣本中的細菌負荷高于WT 對照物。另一項研究表明，NOD2 缺乏可導致普通擬桿菌擴張，其通過影響表達IFN-γ 的上皮內(nèi)淋巴細胞介導小腸異常和炎癥［28］。

NOD2 及其與腸道微生物的相互作用與炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）有關(guān)，包括克羅恩?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcer‐ative colitis，UC）。腸道菌群可通過細菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV）的分泌傳遞免疫調(diào)節(jié)分子，在結(jié)腸炎過程中激活非經(jīng)典的自噬途徑發(fā)揮保護作用。但一些易感基因的變異會阻斷這一保護作用，導致IBD 發(fā)生。CHU 等［29］研究顯示OMV的作用機制與IBD 相關(guān)基因（ATG16L1 和NOD2）密切相關(guān)。在CD 的發(fā)展過程中，NOD2 突變是已知最強的遺傳危險因素之一。據(jù)報道，NOD2 基因（SNP8、SNP12 和SNP13）的3 個主要單核苷酸多態(tài)性與CD 有關(guān)，并導致胞壁酰二肽的功能表型喪失［30］。REHMAN 等［27］通過CD 患者的回腸活檢和糞便研究發(fā)現(xiàn)，無論是否有NOD2SNP13 突變，攜帶NOD2 變異體的患者體內(nèi)擬桿菌門和厚壁菌門比例均增加。KNIGHTS 等［31］對從CD、UC 和對照患者中收集的178 個腸道樣本進行了基因分型，以確定NOD2的危險等位基因，并表明NOD2復合基因型與微生物組成的變化顯著相關(guān)，特別是盲桿菌和大腸桿菌。

3.2 NLRP3 NLRP3 可對各種微生物（包括共生微生物）、微生物產(chǎn)物和代謝物做出反應［32］。然而在針對基因敲除或突變的NLRP3 小鼠進行的腸道炎癥模型實驗中，不同實驗室得出了相互矛盾的結(jié)果。一些研究認為NLRP3 通過限制致病菌維持腸道穩(wěn)態(tài)的保護作用；但另一些研究認為，由微生物激活的NLRP3 有助于疾病的發(fā)生發(fā)展［33-34］。ZAKI等［35］報道了DSS-和2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）-結(jié)腸炎模型中NLRP3?/?小鼠炎癥表型惡化，他們將NLRP3 的保護作用歸因于非造血細胞產(chǎn)生IL-18，從而促進腸道微生物與宿主免疫細胞間上皮屏障的完整性。事實上，NLRP3?/?小鼠經(jīng)歷了菌血癥，抗生素的使用能夠改善其惡化的結(jié)腸炎表型，這一過程直接涉及了微生物。ALLEN等［36］發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，在NLRP3、Asc 或Casp1 缺乏的小鼠中，AOM-DSS 誘導的腫瘤模型炎癥表型增加，腫瘤負荷增加。骨髓嵌合體實驗證實了NLRP3 介導的保護依賴于NLRP3 炎癥組分在造血細胞中的表達。雖然結(jié)論不同，但這兩項研究都表明NLRP3 與共生微生物間的相互作用對腸道穩(wěn)態(tài)和抵御炎癥至關(guān)重要。

HIROTA等［37］直接探究了NLRP3對共生微生物群落的影響，并觀察到NLRP3?/?小鼠結(jié)腸炎表型惡化，IL-1β、IL-10 和TGF-β 表達減少，并將表型與巨噬細胞和中性粒細胞對微生物產(chǎn)物的反應受損聯(lián)系起來。該研究還發(fā)現(xiàn)，與來自同窩的WT 對照相比，NLRP3?/?小鼠產(chǎn)生了一個獨特的微生物群，抗菌分泌物減少且結(jié)腸β-防御素表達發(fā)生改變。通過末端限制片段長度多態(tài)性分析，HIROTA 等［37］發(fā)現(xiàn)了幾種在WT 或NLRP3?/?小鼠中更豐富的細菌種類，包括腸桿菌科、分枝桿菌和梭菌屬成員。該研究首次表征了NLRP3對腸道微生物組成的影響。

與以上研究相反，BAUER 等［38］認為NLRP3 在結(jié)腸炎中發(fā)揮促炎和致病作用。該研究表明，NLRP3?/?動物結(jié)腸炎表型改善，體重減輕，組織學評分較低，并提示了巨噬細胞產(chǎn)生的IL-1β 在疾病發(fā)病機制中發(fā)揮作用。該團隊發(fā)表的后續(xù)研究直接檢測了腸道微生物群對NLRP3 缺乏小鼠DSS-結(jié)腸炎嚴重程度的影響［39］。他們將保護作用與黏膜固有層中CD103+DCs 的增加聯(lián)系起來，這一發(fā)現(xiàn)在MAK'ANYENGO 等［40］的報道中得到擴展：NLRP3?通過IL-1β 抑制CD103+DCs。而后的一項研究則報道了NLRP3 及其與腸道微生物群在腸道炎癥背景下相互作用的有害性［41］。這些研究共同表明NLRP3在腸道炎癥過程中發(fā)揮有害作用。

總之，這些研究探討了在腸道穩(wěn)態(tài)和炎癥背景下NLRP3-微生物相互作用的影響，并提供了共生菌群與炎癥途徑間一個不太確定的聯(lián)系。證據(jù)顯示NLRP3在常駐免疫細胞和非造血細胞中可通過IL-18促進屏障完整性，并通過分泌IL-1β 和AMPs 維持共生細菌的“健康”平衡［40，42］。同時，研究還認為某些共生體可為循環(huán)免疫細胞中主要NLRP3 炎癥小體的激活提供第一信號，以促進有害的炎癥反應。其中一些相互矛盾的發(fā)現(xiàn)可能取決于環(huán)境因素：如先前存在的微生物區(qū)系負荷和組成、住房環(huán)境、使用的對照小鼠（是否在同一設施中飼養(yǎng)等）、動物飼料及疾病誘導過程等細節(jié)［37-40，42］。

3.3 NLRP6 研究表明，腸道NLRP6 優(yōu)先在腸細胞和杯狀細胞中表達，并在調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)、抵御感染、自身免疫反應和腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮重要作用［43］。2011 年，ELINAV 等［44］首次報道了NLRP6-ASC 炎癥體信號對腸道微生物群的塑造作用，其可調(diào)節(jié)宿主對化學劑誘導的結(jié)腸炎免疫反應。該課題組還研究了NLRP6-微生物群落相互作用在AOM-DSS-CRC模型發(fā)病機制中的影響，并在NLRP6和Asc 缺乏的小鼠中觀察到腫瘤發(fā)生增強，并可傳播到同窩飼養(yǎng)的WT 小鼠中［45］。腸道病原體在胃腸道生理中可觸發(fā)多種損傷，包括運動減少和內(nèi)在腸相關(guān)神經(jīng)元丟失。近期有研究揭示了神經(jīng)元特異性NLRP6 是感染引起的固有腸相關(guān)神經(jīng)元死亡的主要效應器，其可通過控制腸道微生物來逆轉(zhuǎn)［46］。該研究為NLRP6 與腸道微生物群間相關(guān)性的研究提供了另一條線索。

為進一步了解炎癥體如何參與維持健康的宿主-微生物穩(wěn)態(tài)，LEVY等［47］對與WT或Asc缺乏小鼠同窩飼養(yǎng)的無菌小鼠糞便樣本進行代謝組學分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物?；撬?、組胺和精胺可通過誘導上皮IL-18分泌和下游AMP產(chǎn)生參與NLRP6炎癥小體的調(diào)節(jié)，并推測這些微生物代謝物調(diào)節(jié)了微生物群落、宿主生理和疾病易感性。近期有研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類代謝物芹菜素也可通過NLRP6 依賴的信號通路保護DSS誘導的結(jié)腸炎［48］。由于DSS誘導的結(jié)腸炎模型更適合研究上皮損傷和修復過程中的宿主反應，而不適合研究整個發(fā)病機制，HARA等［49］利用IL-10缺陷小鼠增加致病性Th1反應，并使其發(fā)展為慢性小腸結(jié)腸炎模型，以研究NLRP6-微生物相互作用在自發(fā)性結(jié)腸炎中的影響。該研究證明，IL-10/NLRP6 雙基因敲除小鼠更容易發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎，并存在一個改變的微生物區(qū)系，且阿克曼氏菌豐度增加；還強調(diào)了NLRP6 如何通過限制特定共生菌的定植來維持腸道穩(wěn)態(tài)新機制。

然而，并不是所有群體都將NLRP6 作為塑造腸道微生物群和調(diào)節(jié)腸道炎癥的標志性宿主因素。2017 年有研究表明，與同窩對照組相比，NLRP6 的遺傳背景對腸道微生物組成無直接影響，NLRP6 缺乏不能提高小鼠對DSS 誘導的結(jié)腸炎易感性［50-51］。GáLVEZ ERIC 等［52］在糞便物質(zhì)轉(zhuǎn)移實驗中進一步支持了NLRP6 對腸道微生物群的調(diào)節(jié)功能。而TOUBAI等［53］則發(fā)現(xiàn)骨髓移植后NLRP6在胃腸道移植物抗宿主病中的致病作用不受微生物群影響。WLODARSKA 等［54］研究表明，NLRP6 缺乏可導致杯狀細胞自噬消失，并可通過減少黏蛋白顆粒胞吐影響?zhàn)ひ簩有纬啥苯佑绊懫涔δ?。由于黏蛋白產(chǎn)生受損，NLRP6 缺乏的小鼠更易受腸道病原體感染，且不能維持微生物穩(wěn)態(tài)。該結(jié)果顯示NLRP6 炎癥小體缺乏會導致腸道微生物群落組成和生物位置分布變化。更重要的是，這一發(fā)現(xiàn)與VOLK 等［55］使用同窩控制的NLRP6 缺乏小鼠進行的另一項研究結(jié)果不同。通過一系列體內(nèi)外分析，VOLK 等［55］認為，NLRP6 缺乏小鼠形成的黏液層在功能上與WT小鼠難以區(qū)分。

針對這些不可忽視的矛盾，持相反觀點的研究者就如何盡量減少實驗差異，更好地研究腸道微生物群與宿主免疫系統(tǒng)間的因果作用發(fā)表了意見。即未來的微生物群研究應包括多種互補的實驗模式，不應僅依賴于某一種方法，因為相對于無菌定植小鼠，不同的表型可能發(fā)生在同窩控制小鼠的研究中，原因如下：首先，糞便轉(zhuǎn)移過程中大量細菌內(nèi)流不是一個生理過程，且可能導致定植抗性或炎癥反應；第二，不同器官內(nèi)細菌種類和群落分布不均，糞便中的微生物與盲腸或結(jié)腸中的微生物區(qū)系不同，可能不代表特定胃腸道區(qū)域的真實微生物群落，此外，許多厭氧菌可能在糞便收集或處理時間內(nèi)已經(jīng)死亡，在這種情況下，雖然糞便微生物轉(zhuǎn)移或無菌小鼠再克隆是微生物研究的有效方法，但應共同使用同窩育種策略來分析宿主的遺傳學影響［42］。

3.4 NLRC4 激活NLRC4 炎癥體可產(chǎn)生IL-1β 和IL-18，并可誘導caspase 介導的細胞死亡。有趣的是，雖然ASC 會增強NLRC4 誘導的caspase-1 活化，但NLRC4 炎癥體的激活不需要ASC［56-58］。ROM‐BERG等［59］指出NLRC4的功能增強型突變與人類腸道和全身自身炎癥性疾病有關(guān)。NLRC4 的雜合性功能增強型突變是導致嬰兒小腸結(jié)腸炎的重要原因之一，是一種以嬰兒腹瀉和與皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟巨噬細胞活化相關(guān)的全身表現(xiàn)為特征的慢性炎癥性疾病。此外，其他NLRC4突變也被認為與表型類似于NLRP3 的相關(guān)自身炎癥性疾病綜合癥相關(guān)。但腸道微生物群在人NLRC4 炎癥疾病中的潛在作用還未見報道。

小鼠模型的研究揭示了NLRC4 在腸道炎癥和炎癥誘導的腫瘤發(fā)生中的保護作用。CARVALHO等［60］發(fā)現(xiàn)與同窩對照的WT 小鼠相比，NLRC4 缺乏小鼠會出現(xiàn)更嚴重的DSS 誘導的結(jié)腸炎，且NLRC4缺乏小鼠更易受腸道沙門氏菌感染，并認為這些小鼠的死亡率增加與IL-1β 減少有關(guān)。另一項研究表明，NLRC4 在AOM-DSS-CRC 模型中具有類似的保護作用［61］。該研究發(fā)現(xiàn)，與年齡和性別匹配的WT小鼠相比，NLRC4 缺陷小鼠的腫瘤數(shù)量和腫瘤負荷顯著增加。但ALLEN 等［36］的研究卻發(fā)現(xiàn)與類似治療的WT動物相比，NLRC4?/?小鼠的疾病進展或結(jié)果無明顯差異。這一矛盾可能是由不同結(jié)構(gòu)微生物組成的差異導致。筆者認為有必要進行進一步的嚴格批判性實驗來研究NLRC4 在調(diào)節(jié)腸道微生物群組成及其對腸道疾病的潛在影響。

4 展望

宿主免疫與腸道微生物間的相互作用及其在腸道穩(wěn)態(tài)和炎癥背景下的潛在應用是一個值得研究的領(lǐng)域。然而，不同實驗室間相互矛盾的結(jié)論以及研究者對單個實驗結(jié)果重現(xiàn)性的關(guān)注均表明微生物領(lǐng)域研究的挑戰(zhàn)性日益增強。既往的許多研究沒能充分認識到非遺傳因素的影響（如住房條件、飲食、小鼠設施、疾病模型和測序方法），這些因素已被證實對微生物群組成具有重要影響，且可能導致不一致的結(jié)果。寄主-微生物的相互作用仍是一個年輕且日益精進的領(lǐng)域供科學家探索。有了這些新的共識，在研究宿主對微生物群落結(jié)構(gòu)影響的同時，進行標準化的同窩控制實驗設計（包括無菌小鼠和糞便微生物群移植）以盡量減少非遺傳因素造成的混雜效應對研究成果至關(guān)重要［42］。