王玉虎， 趙明敏， 鄭紅麗

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特010019

植物內(nèi)生固氮菌（endophytic diazotroph）是指與宿主植物進(jìn)行聯(lián)合固氮并且定殖于植物體內(nèi)的一類微生物[1]。它們不需要與植物產(chǎn)生結(jié)瘤，就可以侵入到宿主植物體內(nèi)并定殖，可以直接或間接提供植物生長(zhǎng)所需要的氮源，除了固氮作用外已經(jīng)被證實(shí)的有產(chǎn)IAA、溶磷、產(chǎn)鐵載體、拮抗病原菌等功能，可用于生物防治、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等領(lǐng)域。植物內(nèi)生固氮菌的研究始于20世紀(jì)60年代，之后在牧草、甘蔗、水稻等多種作物中均分離出了內(nèi)生固氮菌。由于內(nèi)生固氮菌定殖在植物體內(nèi)，相比于根際和共生固氮菌位置優(yōu)勢(shì)更明顯。因此，研究?jī)?nèi)生固氮菌與植物之間的關(guān)系對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、可持續(xù)發(fā)展等具有重要意義。

1 植物內(nèi)生固氮菌的發(fā)現(xiàn)

1961 年,D?bereiner 等[2]在嘗試研究甘蔗固氮系統(tǒng)時(shí)，首次從根際分離到固氮細(xì)菌——拜葉林克氏菌（Beijerinck），這也是研究者首次證實(shí)禾本科植物存在生物固氮潛力。D?bereiner 等[3]在1974 年研究了熱帶牧草生物固氮系統(tǒng)，其由固氮螺菌（Azospirillum）和牧草形成，而且還發(fā)現(xiàn)固氮螺菌大多數(shù)聚集在牧草根表，但是有一部分菌株可以穿過(guò)根表皮細(xì)胞壁侵入到牧草根內(nèi)部，這些侵入到植物體內(nèi)的菌不與宿主植物形成特殊的共生組織，而是處于一種沒(méi)有表型特征而且松散的共生狀態(tài)，這一現(xiàn)象被稱為聯(lián)合共生固氮作用（associative symbiotic nitrogen fixation），這種固氮類型是介于根際自生固氮和結(jié)瘤固氮之間的過(guò)渡類型。D?bereiner 團(tuán)隊(duì)還從甘蔗組織內(nèi)部發(fā)現(xiàn)并分離出固氮菌，因其具有將乙醇氧化成乙酸的能力而且能夠在酸性條件下固氮，所以被命名為醋酸固氮菌（Acetobacter diazotrophicus）。這些菌在甘蔗根和莖中大量存在，并且可以在含糖培養(yǎng)基上表現(xiàn)出最佳生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，這正是其在甘蔗汁中普遍存在的生長(zhǎng)條件[4]，之后又被重命名為固氮葡糖醋桿菌[5]。Helvécio 等[6]采用乙炔還原法測(cè)定了2 種熱帶牧草中的固氮酶活性，并用15N 標(biāo)記證實(shí)了植物的固氮能力。1978 年Tarrand 等[7]命名了拜葉林克氏菌屬（Azospirillum lipoferum）和巴西固氮螺菌屬（Azospirillum brasilense）的新型菌株，這2種菌是由D?bereiner 從馬唐屬和小麥中分離出來(lái)的。雖然越來(lái)越多的固氮菌被分離出來(lái)，但是對(duì)于固氮菌的劃分一直并未明確。直到1997 年Joséi 等[8]研究了根際、內(nèi)生、兼性和專性固氮菌，然后根據(jù)固氮菌菌體是否可以侵入植物組織內(nèi)部并定殖，將固氮菌分為根際固氮菌（rhizosphere diazotrophs）和內(nèi)生固氮菌（endophytic diazotrophs），之后相繼發(fā)現(xiàn)甘蔗、水稻、玉米、牧草等具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物中均存在明顯的生物固氮現(xiàn)象。

植物內(nèi)生固氮菌能否順利侵入植物體內(nèi)并定殖是發(fā)生聯(lián)合固氮作用的決定性因素[9]。植物內(nèi)生固氮菌由于在植物組織內(nèi)部，相比于根外占據(jù)著更加有利的地位，具有供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、分泌植物生長(zhǎng)激素等優(yōu)勢(shì)，相較于根外更容易形成高效固氮體系。內(nèi)生固氮菌與植物的獨(dú)特關(guān)系和環(huán)境特點(diǎn)潛力，使其成為了一個(gè)具有重要意義的研究方向。

2 內(nèi)生固氮菌與多種作物共生

內(nèi)生固氮菌根據(jù)其特點(diǎn)不同，又可分為兼性內(nèi)生固氮菌和專性內(nèi)生固氮菌2 類。國(guó)外在甘蔗上的內(nèi)生固氮菌相關(guān)研究報(bào)道較多。1961 年,D?bereiner[2]首先在甘蔗根際分離到大量的Beijerinck屬細(xì)菌，并提出了甘蔗聯(lián)合固氮作用（sugarcane associative nitrogen fixation）的概念。隨后陸續(xù)報(bào)道在甘蔗的根、莖、葉及根際中分離到了多種固氮細(xì)菌。2011 年我國(guó)科學(xué)家在廣西種植的不同甘蔗品種中分離出內(nèi)生固氮菌[10]。黃杏等[11]通過(guò)采用3 種不同固氮菌的混合菌液接種甘蔗，發(fā)現(xiàn)甘蔗的根系活力、碳水化合物及蛋白質(zhì)含量均得到明顯提高。羅霆等[12]采用15N 同位素稀釋法證明在接種固氮菌后，甘蔗的固氮量和固氮百分比均得到提高，同時(shí)，魏春燕等[13]發(fā)現(xiàn)甘蔗基因型對(duì)甘蔗與固氮菌間的聯(lián)合互作有影響。最近，史國(guó)英等[14]從廣西甘蔗莖基部組織分離篩選到1 株內(nèi)生固氮菌株NN08200，其固氮促生效果明顯，有望研發(fā)成為優(yōu)良固氮微生物肥料生產(chǎn)菌種，并可進(jìn)一步用于甘蔗聯(lián)合固氮菌作用機(jī)理的相關(guān)研究。

除了甘蔗之外，國(guó)內(nèi)的科學(xué)家在水稻和玉米上的內(nèi)生固氮菌研究報(bào)道最多，如丘元盛等[15]在廣東省水稻根分離出來(lái)的糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faccalis）。研究者還從水稻上分離到內(nèi)生陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[16]。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)譚志遠(yuǎn)團(tuán)隊(duì)[17]在野生稻內(nèi)生固氮菌方面的研究比較深入，已取得了一系列研究成果。該團(tuán)隊(duì)在普通野生稻、澳洲野生稻、岑溪藥用野生稻、藤縣藥用野生稻中均分離到多種內(nèi)生固氮菌，并證明這些分離到的菌不僅在遺傳方面具有多樣性，而且還含有一些高固氮酶活性的菌株，可以達(dá)到42.52 μmol C2H4·mL-1·h-1。該團(tuán)隊(duì)將普通野生稻分離出的內(nèi)生固氮菌進(jìn)行回接實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其能夠顯著促進(jìn)水稻生長(zhǎng)。野生稻不僅是我國(guó)的一種重要種質(zhì)資源，也是寶貴的功能微生物資源庫(kù)[18]。在野生稻內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的固氮菌目前有31 個(gè)屬74 個(gè)種，其中兼性內(nèi)生固氮菌占絕大部分，并且寄主范圍廣、分布地域全球化。野生稻內(nèi)生固氮菌存在巨大發(fā)掘空間，現(xiàn)有研究大多集中于其促進(jìn)生長(zhǎng)、抗病害作用等方面。

自從1996 年美國(guó)科學(xué)家Palus 等[19]從甜玉米莖內(nèi)分離到可固氮的肺炎克雷伯氏菌（Kelebesilla pneumomiae）以來(lái)，此后相繼在玉米的根、莖、葉上分離到內(nèi)生固氮菌[20]。其中，同一玉米樣品根內(nèi)生固氮菌的多樣性最高，其次是葉，莖中最低[21]。一些玉米根、莖、葉上分離到的固氮菌株，如L1A1、L1A4、L1B9 和 L2A2 是多功能固氮菌，有研究者對(duì)這4 株菌的固氮、溶磷、拮抗、促生等一系列指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)后，將這4菌株接種到小麥上，發(fā)現(xiàn)小麥的農(nóng)藝性狀有明顯改善，植株更加健壯，幼苗的長(zhǎng)勢(shì)也更好，并且在一定程度上可以提高小麥的抗干旱能力[22]。覃姚紅等[23]研究表明，玉米種子內(nèi)生固氮菌對(duì)小麥生長(zhǎng)及抗旱能力也有促進(jìn)作用。此外，科學(xué)家們?cè)谛←湣⒑瘫究颇敛?、蔬菜、果?shù)、林木上也分離鑒定出了不同類型的內(nèi)生固氮菌，并研究了固氮活性及其菌株特性[24-28]，這引起了人們對(duì)植物內(nèi)生生物固氮作用的廣泛關(guān)注。

近年來(lái)，內(nèi)生固氮菌在薯類作物上的報(bào)道較少。Sessitsch 等[29]用 TRFLP 和 DGGE 技術(shù)相結(jié)合分析了不同馬鈴薯品種的地上莖、根及塊莖內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。Burkholderia vietnamiensisstrain RS1 是從甘薯根部分離獲得的內(nèi)生固氮菌，其基因組大小為6 542 727 bp[30]?；蚪M中含有固氮基因 nif 基因簇（46.4 kb），由61 個(gè)開(kāi)放閱讀區(qū)組成框架，包括nifQXNEKDHOTSZZBAUVPW 和與nif相關(guān)的基因（modACE、fdxBN 和fixAB）。此外，基因組中鑒定出幾個(gè)與植物生長(zhǎng)促進(jìn)有關(guān)的基因，如產(chǎn)鐵載體基因和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸的降解基因[30]。張磊等[31]從內(nèi)蒙古武川縣的馬鈴薯根樣品中采用固氮基因nifH擴(kuò)增方法獲得8 株內(nèi)生固氮菌，其中3 株為短芽孢桿菌屬（Brevibacterium），3 株為芽孢桿菌屬（Bacillus），2 株為泛菌屬（Pantoea）。目前在不同植物上分離得到的內(nèi)生固氮菌詳見(jiàn)表1。

表1 不同植物上分離到的內(nèi)生固氮菌Table 1 Endophytic nitrogen-fixing bacteria isolated from different plants

3 植物內(nèi)生固氮菌的侵入途徑與定殖

根據(jù)已有研究，植物體內(nèi)的內(nèi)生菌來(lái)源主要有2 種方式，第1 種是通過(guò)種子和塊根、塊莖等無(wú)性繁殖材料。這些菌侵入到種子內(nèi)并且能夠系統(tǒng)地定殖，從種子萌發(fā)一直到植物開(kāi)花結(jié)實(shí)始終存在于植物體內(nèi)，伴隨著植物整個(gè)生長(zhǎng)周期，且植物與內(nèi)生菌形成了互利共生的關(guān)系，如賽魯普蒂卡草螺菌是前人從水稻的種子內(nèi)分離得到的[32-33]。第2 種方式是通過(guò)根圍和葉圍侵入，以根圍侵入的方式為主。Hallmann 等[32]在分離的棉花內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)有82%也存在于根際中并且能夠分離得到。Boddey[34]研究認(rèn)為，甘蔗固氮菌是通過(guò)莖切口進(jìn)入并且繁殖內(nèi)生寄生菌。在玉米和其他禾本科牧草的內(nèi)生固氮菌也多數(shù)來(lái)自根圍。Sessitsch等[35]研究了馬鈴薯根、地上莖、塊莖3 個(gè)不同部位的內(nèi)生菌，內(nèi)生菌多樣性方面健康馬鈴薯植株明顯高于受脅迫植株，并證明內(nèi)生菌相當(dāng)一部分起源于宿主植物根際。

種子的內(nèi)生固氮菌主要通過(guò)種皮裂開(kāi)的縫隙、種臍或者維管系統(tǒng)進(jìn)入種子內(nèi)部，并借助種子調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[36]。來(lái)源于根圍或葉圍的內(nèi)生菌侵入寄主植物主要通過(guò)植物自然孔口（氣孔、表皮裂隙、皮孔等）、傷口（機(jī)械損傷、病害損傷、自然災(zāi)害損傷等）和根毛。植物根生長(zhǎng)的初期因幼根組織較弱，凱氏帶尚未形成，成為固氮菌侵入的最佳時(shí)期。根皮層細(xì)胞間、葉肉、葉薄壁組織和維管組織中的木質(zhì)部是內(nèi)生固氮菌侵入后定殖最多的部位,根（根毛）表皮細(xì)胞同樣分布著較多的內(nèi)生固氮菌[37]。內(nèi)生固氮菌還可以利用宿主植物體內(nèi)的分泌物或者其他產(chǎn)物，如重氮營(yíng)養(yǎng)醋桿菌（Acetobacter diazotrophicus）能夠利用甘蔗細(xì)胞間溶液生存并定殖于甘蔗體內(nèi)，這是因?yàn)榧?xì)胞間溶液的蔗糖濃度和pH比較適合，并且成分接近培養(yǎng)重氮營(yíng)養(yǎng)醋酸桿菌的培養(yǎng)基。固氮醋酸桿菌的侵入是由根尖和側(cè)根的發(fā)生部位開(kāi)始，它們從根部侵入后進(jìn)入上皮細(xì)胞，從莖部的木質(zhì)部導(dǎo)管向上傳輸?shù)接啄劢M織和葉肉組織，且能侵入甘蔗根毛形成侵染線樣結(jié)構(gòu)[38]（表2）。也有研究表明，內(nèi)生固氮菌表面的纖維素酶和果膠酶是可以改變寄主植物細(xì)胞膜通透性的，從而引起寄主植物細(xì)胞K+外流，細(xì)胞間隙溶液的 pH 從 5.5 升高到 7.0～7.5，使寄主植物細(xì)胞中蔗糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流入細(xì)胞間隙，從而為內(nèi)生固氮菌的定殖創(chuàng)造條件[39]。

表2 幾種代表性內(nèi)生固氮菌侵入植物的途徑Table 2 Pathway of several representative endophytic nitrogen-fixing bacteria invading plants

據(jù)推測(cè)，內(nèi)生固氮菌定殖前會(huì)與植物進(jìn)行一系列的相互作用，這些作用與根瘤菌和植物特異性結(jié)合比較相似。根瘤菌表面產(chǎn)生的多糖可以與豆科植物根系分泌的豆凝素特異性識(shí)別，然后結(jié)合并吸附在根毛上。某些細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)能夠在內(nèi)生固氮菌侵入過(guò)程中起到接觸和識(shí)別作用，特別是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜上LPS的O-抗原特異側(cè)鏈在細(xì)菌的特異性識(shí)別和接觸過(guò)程中發(fā)揮重要作用[40]。此外，也有研究者推測(cè)內(nèi)生固氮菌的定殖部位與高效固氮機(jī)制是由于內(nèi)生固氮能夠誘導(dǎo)呼吸系統(tǒng)變化，使環(huán)境中的氧分壓降低，呼吸作用變得更加活躍并且能夠高效固氮。推測(cè)是在這種“超誘導(dǎo)”的狀態(tài)下，固氮酶的鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜上聚集，與形成的高效固氮功能膜“diazosomes”有關(guān)[41]。

圖1 氮從重氮營(yíng)養(yǎng)體向寄主植物的轉(zhuǎn)移模型[31]Fig.1 Model for nitrogen transfer from diazotroph to host plant[31]

4 植物內(nèi)生固氮菌的固氮機(jī)理

固氮菌之所以能夠固氮是因?yàn)槠潴w內(nèi)有一種具有特殊功能的蛋白質(zhì)——固氮酶，而固氮功能與固氮酶結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因、活性密切相關(guān)。

4.1 固氮酶結(jié)構(gòu)及調(diào)控基因

固氮酶由固氮基因nif編碼，nif一般存在于細(xì)菌的質(zhì)?；蛘呷旧w上。在固氮菌的基因組中，固氮相關(guān)的nif（vnf/anf）基因都是作為一個(gè)或幾個(gè)基因簇存在的，稱為固氮基因簇（nitrogen-fixationgene cluster），是生物固氮遺傳基礎(chǔ)的核心[42]。人們可利用已知固氮菌nif基因簇中的共有基因簇特征序列，進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)新的固氮菌。目前已知的固氮酶包括鉬鐵（MoFe）固氮酶、釩鐵（VFe）固氮酶和鐵鐵（FeFe）固氮酶3 種類型。雖然這3 種固氮酶中所含金屬離子不同，但是這些固氮酶亞型在結(jié)構(gòu)催化機(jī)制和系統(tǒng)進(jìn)化上是相關(guān)的[43]。固氮酶由兩部分組成（圖2）:nifH編碼的鐵蛋白（又稱為固氮還原酶）和nifDK編碼的鉬鐵蛋白(又稱為固氮酶)，nifD編碼鉬鐵蛋白的 α 亞基，nifK編碼鉬鐵蛋白的β 亞基[44]。當(dāng)這2 種蛋白形成一種固氮酶復(fù)合物后才具有催化氮還原成氨的能力，單獨(dú)任何一個(gè)都不具有固氮活性。鐵蛋白負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移電子給鉬鐵蛋白，其是1 個(gè)由Fe4-S4簇橋連的同源二聚體[45]，包含在2個(gè)亞基之間的界面上，通過(guò)每個(gè)亞基中的2 個(gè)半胱氨酸殘基與之結(jié)合。鉬鐵蛋白負(fù)責(zé)鐵蛋白與鐵鉬輔因子之間的電子轉(zhuǎn)移，它是 1 個(gè) α2β2異四聚體，含有 1 個(gè) P 簇（Fe8-S7）。鐵鉬輔因子是1 個(gè)（7Fe-Mo-9S-homocitrate-X）簇，作為底物結(jié)合和還原的位點(diǎn)偶聯(lián)Mg-ATP 水解釋放的自由能，鐵蛋白與鉬鐵蛋白共同催化N2還原為NH3的反應(yīng)。如圖2所示，當(dāng)鐵蛋白與鉬鐵蛋白互作時(shí)，F(xiàn)e 蛋白中的Fe4S4團(tuán)簇與MoFe 蛋白中的P團(tuán)簇接近，然后電子被轉(zhuǎn)移到鐵鉬輔因子，N2分子被還原成NH3分子。整個(gè)反應(yīng)可以寫(xiě)為式（1）。

圖2 固氮酶復(fù)合物（PDB ID 1N2C）三維結(jié)構(gòu)[44]Fig 2 Three dimensional structure of the nitrogenase complex(PDB ID 1N2C)[44]

比較所有測(cè)序的固氮菌基因簇表明，至少有6 個(gè)保守基因:nifH、nifD、nifK、nifE、nifN和nifB，并且它們都是固氮所必需的[46]，其中，6 個(gè)共有基因中至少有3 個(gè)位于1 個(gè)連續(xù)的區(qū)域內(nèi)，通常是nifHDK成簇存在；也有nifDK與nifEN相鄰的情況；也有的6 個(gè)共有基因位于基因組內(nèi)的一個(gè)單獨(dú)區(qū)域內(nèi)，但是這種情況較少見(jiàn)。

4.2 固氮酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制

在某些固氮光合細(xì)菌和固氮螺菌中，固氮活性在代謝水平上受到調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)最早在深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）中發(fā)現(xiàn)，固氮酶活性調(diào)節(jié)表現(xiàn)為一種關(guān)閉效應(yīng)（switch-off）。當(dāng)光關(guān)閉或者將效應(yīng)物（銨離子或谷氨酰胺）添加到固氮培養(yǎng)物中時(shí)，固氮酶活性喪失。當(dāng)光被接通或添加的效應(yīng)物被代謝，固氮酶活性恢復(fù)。在巴西固氮螺菌中能量的關(guān)閉效應(yīng)是由氧氣的去除引起的。在分子水平上，固氮酶活性喪失是由于鐵蛋白亞基之一精氨酸的可逆ADP 核糖基化(圖3)，在深紅紅螺菌中為Arg101。Arg101 位于Fe 蛋白和MoFe 蛋白的相互作用區(qū)域內(nèi)，因此，修飾在空間上阻礙了兩種蛋白的相互作用，從而無(wú)法發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。催化可逆修飾的兩種酶是DraG（dinitrogenase reductase activating glycohydrolase）和 DraT（dinitrogenase reductase ADP-ribosyl transferase）。目前人們對(duì)DraG 和DraT 在分子水平上的了解十分有限，關(guān)于DraT 的調(diào)控知之甚少，但可以確定PII蛋白在響應(yīng)細(xì)胞的氮狀態(tài)時(shí)參與了這種調(diào)控。PII蛋白構(gòu)成1 個(gè)三聚體蛋白家族，在原核細(xì)胞中調(diào)節(jié)與氮代謝相關(guān)或部分氮代謝的過(guò)程。DraG活性調(diào)節(jié)已確定與深紅紅螺菌中的色素細(xì)胞（質(zhì)）膜相關(guān)[44]。

圖3 DraT和DraG對(duì)Fe蛋白的可逆ADP核糖基化作用[46]Fig 3 Reversible ADP-ribosylation of the Fe protein by DraT and DraG[46]

目前，在甘蔗固氮葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）上的研究已經(jīng)十分成熟，在固氮機(jī)理、酶和基因等方面的研究比較深入。先前的研究發(fā)現(xiàn)固氮葡糖醋桿菌上的nifA基因位于染色體上，并且對(duì)O2和NH4+敏感，該基因的排列和功能與其他固氮菌相似，固氮酶的最適催化pH和最大活性pH 為7.0，并且固定同化的氮是谷氨酰胺（Gln）合成酶催化的。有研究者從固氮酶上分離到結(jié)構(gòu)基因GlnA，并且利用插入突變技術(shù)確定了表達(dá)調(diào)控蛋白的GlnB同源基因（GlnB,Glnk1和Glnk2）的存在，這些調(diào)控蛋白能夠感知銨離子濃度，進(jìn)而調(diào)控固氮酶的表達(dá)和活性[47]。巴西桿菌的固氮調(diào)控模型也已經(jīng)被提出，其中PⅡ蛋白直接或間接地控制了nif基因轉(zhuǎn)錄激活因子NifA的活性，尿苷化形式的PⅡ蛋白是活性nifA 蛋白所必需的，而且尿苷化形式的PⅡ蛋白是雙功能尿苷轉(zhuǎn)移酶/尿苷去除酶GlnD 催化的。此外，有研究者利用GlnD突變株證實(shí)GlnD 蛋白參與解除NifL 對(duì)NifA活性的抑制[48]。

4.3 固氮酶氧保護(hù)機(jī)制

固氮酶還有一種防止氧傷害的保護(hù)機(jī)制[49]。固氮作用必須在無(wú)氧條件下進(jìn)行，這是因?yàn)楣痰笇?duì)氧極其敏感。鉬鐵固氮酶是一種氧敏感酶，氧氣會(huì)影響固氮酶活性，但是大多數(shù)固氮菌必須在有氧條件下才能生活，因此固氮菌自身產(chǎn)生了一種保護(hù)機(jī)制來(lái)防止氧損傷固氮酶。目前已經(jīng)明確的固氮酶保護(hù)機(jī)制，有呼吸保護(hù)、構(gòu)象保護(hù)、“雙保險(xiǎn)”或調(diào)節(jié)機(jī)制3種。

4.3.1 呼吸保護(hù) 固氮菌屬的許多細(xì)菌通過(guò)提高自身的呼吸強(qiáng)度迅速耗盡固氮部位周圍的氧，以使固氮酶處于無(wú)氧的環(huán)境中從而免受氧的傷害。在呼吸保護(hù)中，呼吸鏈的組成部分涉及氰化物敏感的細(xì)胞色素帶抗氰化物細(xì)胞色素巴酚氧化酶，在高氧條件下固氮酶保護(hù)起主要作用。

4.3.2 構(gòu)象保護(hù) 大多數(shù)固氮菌體內(nèi)均含有一種特殊功能的蛋白質(zhì)——Fe-SⅡ蛋白，其能夠起到構(gòu)象保護(hù)的作用，在氧分壓增高時(shí)，該蛋白與固氮酶結(jié)合，此時(shí)，固氮作用隨著固氮酶構(gòu)象的改變而喪失；固氮酶周圍的氧濃度降低后，該蛋白便從酶分子上解離，固氮酶恢復(fù)原有的構(gòu)象和固氮能力。Gluconacetobacter diazotrophicus還可以利用菌落黏液的路徑長(zhǎng)度來(lái)維持最佳的O2濃度，且不抑制固氮酶活性和細(xì)胞代謝。呼吸保護(hù)和構(gòu)象保護(hù)均涉及Fe-SⅡ蛋白協(xié)同作用。

4.3.3 “雙保險(xiǎn)”式調(diào)節(jié)機(jī)制 通過(guò)加強(qiáng)呼吸作用與改變構(gòu)象兩者相互協(xié)調(diào)，組成一個(gè)“雙保險(xiǎn)”式調(diào)節(jié)機(jī)制，以保證固氮酶的活性。

此外，要實(shí)現(xiàn)生物固氮還必須具備以下幾個(gè)基本條件：還原型電子供體、ATP 和Mg2+離子、來(lái)源于水的質(zhì)子、嚴(yán)格的無(wú)氧環(huán)境。實(shí)際上固氮酶的機(jī)理非常復(fù)雜，至今仍有很多問(wèn)題尚不明確。

5 植物內(nèi)生固氮菌對(duì)植物的促生作用及其機(jī)制

內(nèi)生固氮菌侵入植物體內(nèi)后定殖在木質(zhì)部導(dǎo)管并發(fā)揮固氮能力。木質(zhì)部導(dǎo)管可以提供細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的能源、滿足低氧分壓的環(huán)境，還可以提供交換代謝產(chǎn)物的場(chǎng)所，避免與土壤微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)和土壤化合態(tài)氮對(duì)固氮酶活性的抑制作用，固定的氮無(wú)需經(jīng)過(guò)其他方式即可以直接被植物吸收利用。目前已發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生固氮菌多通過(guò)以下幾方面發(fā)揮促生作用。

5.1 為植物提供氮源

內(nèi)生固氮菌都含有固氮酶，能夠大量定殖在植物組織內(nèi)部，而且無(wú)需形成特殊的共生結(jié)構(gòu)或組織就能發(fā)揮固氮作用，這與固氮菌能夠形成被膜或基質(zhì)包圍的內(nèi)生特征有關(guān)[50]。它們可以定殖在宿主植物體內(nèi)，能夠侵入宿主植物的大部分營(yíng)養(yǎng)器官內(nèi)并且發(fā)揮固氮作用，為植物提供可利用的氮源，有些內(nèi)生固氮菌固定的氮素還可以直接被植物吸收同化。由目前的研究表明，這一系列作用不會(huì)引起寄主植物產(chǎn)生任何不良反應(yīng)[51]，有些可以將大氣中固定的氮素一部分提供給宿主吸收利用，其余部分被細(xì)菌自身轉(zhuǎn)化利用，當(dāng)細(xì)菌死亡后釋放出的有機(jī)氮也被植物吸收利用。

5.2 產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)

內(nèi)生固氮菌能分泌的刺激植物生長(zhǎng)的植物激素類物質(zhì)有吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素等[52]。分離自墨西哥的重氮營(yíng)養(yǎng)醋桿菌(Acetobacteria)具有產(chǎn)生長(zhǎng)素（IAA）的能力[53]。林敏[54]分析水稻根系成分時(shí)，發(fā)現(xiàn)糞產(chǎn)堿菌（A.faecalis）存在于水稻根際并且能產(chǎn)生赤霉素、生長(zhǎng)素及玉米素，可以促進(jìn)水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)刺激水稻根的分泌作用。田宏等[55]從草坪草根際得到分離物，對(duì)分離物成分進(jìn)行分析并發(fā)現(xiàn)大部分都能夠產(chǎn)IAA，但產(chǎn)IAA 的能力差異較大,濃度在 3.18～22.3 mg·L-1之間。植物根內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)吲哚-3-丙酮酸（IPyA）、吲哚-3-乙酰胺（IAM）、吲哚-3-乙腈（IAN）和色胺（TAM）等途徑來(lái)合成IAA[56]，從而促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)或者調(diào)節(jié)植物生理代謝活動(dòng)。也有內(nèi)生固氮菌通過(guò)產(chǎn)生鐵載體和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶等其他物質(zhì)來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[57]。陽(yáng)潔等[58]從野生稻中分離到多種內(nèi)生固氮菌，接種后能顯著促進(jìn)水稻生長(zhǎng)。尹坤等[59]從野生稻體內(nèi)分離到1 株變棲克雷伯氏菌（K.variicola），這株菌不僅具有較強(qiáng)的分泌生長(zhǎng)素和鐵載體的能力，還能夠有效促進(jìn)水稻的萌發(fā)和生長(zhǎng)。

5.3 促進(jìn)內(nèi)根際的生理變化

研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生固氮菌具有促進(jìn)內(nèi)根際的生理變化作用。主要表現(xiàn)在促進(jìn)根際多元酚的分泌、促進(jìn)植物根際ATP 含量增加、促使根部氧化酶活性降低，提高還原酶活性。以固氮葡糖醋桿菌為例，其具有糖酵解、戊糖磷酸途徑和一種獨(dú)特的細(xì)胞外醛糖氧化途徑，利用含吡羅-喹啉-醌（PQQ）的葡萄糖脫氫酶將胞外葡萄糖氧化為葡萄糖酸酯[60]。在此過(guò)程中產(chǎn)生的額外還原當(dāng)量主要通過(guò)產(chǎn)生ATP 的電子傳遞鏈傳遞，ATP 同時(shí)用于固定N2過(guò)程，這一途徑在高能量需求和碳限制條件下均可運(yùn)行，同時(shí)還具有溶磷等功能以改善根際內(nèi)生理?xiàng)l件。

5.4 生物防治作用

內(nèi)生固氮菌對(duì)植物病害有顯著的抑制作用。Braun 等[61]在研究成團(tuán)腸桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種成團(tuán)腸桿菌的小麥可以有效防治丁香假單胞菌引起的小麥粒疫病，并且防治率可以達(dá)到45%～74%。楊海蓮等[62]也發(fā)現(xiàn)采用陰溝腸桿菌接種水稻可以對(duì)水稻紋枯病、稻瘟病和白枯病起到一定防治效果。目前，對(duì)固氮菌生防作用的機(jī)理有2種推測(cè)，一種是固氮菌通過(guò)在與致病菌的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中占據(jù)有利生態(tài)地位達(dá)到抑制致病菌的作用；另一種認(rèn)為可能是內(nèi)生固氮菌產(chǎn)生了某種特異性抑菌物質(zhì)，從而發(fā)揮抗病功能[63]。

6 展望

植物內(nèi)生固氮菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然成分，由于長(zhǎng)期的共同進(jìn)化，植物內(nèi)生固氮菌與宿主建立了良好的互利共生關(guān)系。內(nèi)生固氮菌寄生于宿主植物組織內(nèi)，并不引起直觀的表型變化，使該領(lǐng)域的研究具有一定的難度；同時(shí)，由于內(nèi)生固氮菌的生境特殊，并受多種因素的影響，限制了內(nèi)生固氮接種劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。近年來(lái),隨著一些新研究方法的應(yīng)用，包括化學(xué)分析、遺傳工程、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等,推動(dòng)了固氮菌領(lǐng)域的研究深度，使人們進(jìn)一步了解內(nèi)生固氮菌與植物之間的相互關(guān)系，并促進(jìn)了內(nèi)生固氮菌合理運(yùn)用。但目前，仍有很多問(wèn)題尚未解決，如內(nèi)生固氮菌的來(lái)源、侵入的分子機(jī)制、作用特點(diǎn)及人工接種其他植物是否會(huì)造成影響，此外，針對(duì)固氮機(jī)理方面的研究也并不深入，生防機(jī)制方面也只是推測(cè)并未明確。因此，明確植物和內(nèi)生固氮菌的互作關(guān)系，以及內(nèi)生固氮菌與植物根形成固氮體系的機(jī)理等，將更有利于人們了解內(nèi)生固氮菌并充分利用，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。