夏維婷 徐欣欣 周志陽 鄭如如 林 鳳 邊曉麗

宮腔粘連(intrauterine adhesion, IUA)是指由于感染或者損傷等因素引起的子宮內(nèi)膜的基底層破壞，繼而導(dǎo)致宮腔內(nèi)形成粘連或者纖維瘢痕。大量研究證明，雌激素可以在哺乳動(dòng)物的月經(jīng)期后促進(jìn)子宮內(nèi)膜和新生毛細(xì)血管的再生[1]。臨床上雌激素治療通常作為宮腔鏡下子宮內(nèi)膜粘連分離術(shù)后的重要輔助治療手段，可以促進(jìn)受損子宮內(nèi)膜的再生，防止宮腔粘連的復(fù)發(fā)[2]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol-3 kinase/Akt, PI3K/Akt)和ERK1/2信號(hào)通路是由雌二醇(estradiol, E2)激活的兩個(gè)主要的下游信號(hào)通路。研究結(jié)果證實(shí)，這兩個(gè)信號(hào)通路與細(xì)胞的存活、遷移、分化、凋亡存在密切聯(lián)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)并進(jìn)行折疊的場所，許多事件如細(xì)胞暴露于氧自由基,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存的鈣離子耗竭，都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3,4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在許多疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[5]。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)17β-雌二醇對宮腔粘連大鼠子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用，并進(jìn)一步研究PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)變化，從而探討它們在宮腔粘連治療中的可能作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD雌鼠18只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，體質(zhì)量為230～250g，動(dòng)物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK(浙)2015-0009。相關(guān)飼養(yǎng)條件：4只SD大鼠同籠飼養(yǎng)，SPF級(jí)屏障12h光照/12h黑暗周期變化，室溫保持在22±2℃，濕度維持在35%～60%，保證大鼠能夠自由進(jìn)食及飲水。

2.藥品和試劑：(1)主要試劑：4%多聚甲醛購自重慶市北碚化學(xué)試劑廠，蘇木精-伊紅染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Masson染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CD31、GRP78、CHOP、Akt1、p-Akt、ERK、p-ERK多克隆抗體購自英國Abcam公司。(2)17β-雌二醇油溶液的配置：17β-雌二醇購自美國Alfa Aesa公司，使用定量的無水乙醇將17β-雌二醇充分溶解后，加入無菌花生油配制成10μg/100μg的17β-雌二醇油溶液備用。

3.實(shí)驗(yàn)儀器：自動(dòng)酶標(biāo)分析儀購自美國Bio-Rad公司，多功能顯微鏡購自日本Olympus公司，電泳設(shè)備購自美國Bio-Rad公司，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司，病理組織包埋機(jī)購自常州中威電子儀器有限公司，BP211D型電子天平購自德國Sartorius公司。

4.IUA動(dòng)物模型構(gòu)建及分組：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組、模型組及治療組，每組各6只。通過機(jī)械損傷法構(gòu)建大鼠宮腔粘連模型，具體方法如下：每日早上8：00時(shí)對大鼠行陰道涂片觀察，處于動(dòng)情間期的雌鼠用于宮腔粘連模型的構(gòu)建[6,7]。腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，大鼠仰臥位固定，腹部剃毛備皮，用碘伏消毒皮膚，在腹部正中線做長約2cm的切口。逐層切開皮膚和肌肉，暴露腹腔，在大鼠膀胱后方尋找子宮。暴露子宮后，在Y形子宮分叉處上方做一0.5cm的切口，利用刮勺刮除子宮內(nèi)膜至宮腔表面有粗糙感，造成子宮內(nèi)膜損傷。然后縫合子宮切口，并用無菌紗布仔細(xì)止血后，縫合肌層與皮膚。術(shù)后給予肌內(nèi)注射抗生素預(yù)防感染。模型組僅建立機(jī)械性損傷模型，對照組不做任何干預(yù)，治療組造模后當(dāng)天開始每日皮下注射濃度為10μg/100μg的17β-雌二醇油溶液100μg，連續(xù)7天。

5.組織病理學(xué)檢測：固定好的子宮組織進(jìn)行脫水，石蠟包埋，制備成5μm切片，分別進(jìn)行HE染色觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)、Masson染色觀察子宮內(nèi)膜的纖維化程度、CD31免疫組化染色觀察子宮內(nèi)膜新生血管的生成情況。

6.Western blot法檢測子宮內(nèi)GRP78、CHOP、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白：提取組織，采用BCA法進(jìn)行定量，SDS-PAGE電泳，移膜、封閉后，加入目標(biāo)一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)的二抗稀釋液室溫孵育2h，滴加ECL發(fā)光、顯影，采集條帶吸光度值及面積用于統(tǒng)計(jì)分析。以GAPDH條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算蛋白表達(dá)的相對水平。

結(jié) 果

1.大鼠子宮大體及病理形態(tài)學(xué)變化：對照組大鼠子宮表面呈淡粉色，有良好伸展性；模型組大鼠彈性減退，變細(xì)、僵直、甚至發(fā)生積液。治療組較模型組子宮粗細(xì)均勻，彈性尚可，形態(tài)近似對照組(圖1)。HE染色結(jié)果顯示，在模型組，子宮內(nèi)膜表面僅覆蓋一層低柱狀上皮，腺體數(shù)量顯著下降，甚至只觀察到個(gè)別腺體分布在子宮的黏膜下層和基底層。與模型組比較，給予17β-雌二醇干預(yù)后，大鼠子宮內(nèi)膜的腺體數(shù)量有所增加(P<0.01)。Masson染色后可見模型組大鼠的子宮內(nèi)膜纖維化面積較對照組顯著增加(P<0.01)，而給予17β-雌二醇治療后，子宮內(nèi)膜纖維化面積的比例降低(P<0.01，圖2)。

圖1 各組大鼠子宮大體形態(tài)A.對照組；B.模型組;C.治療組

2.各組大鼠子宮內(nèi)膜CD31表達(dá)情況：與對照組比較，CD31的表達(dá)水平在模型組顯著下降(P<0.01)。IUA大鼠給予17β-雌二醇治療后，CD31的表達(dá)水平在受損的子宮內(nèi)膜部位有所上調(diào)(P<0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠子宮HE、Masson染色及CD31的表達(dá)A～F.各組大鼠子宮內(nèi)膜HE染色(A～C.×40；D～F.×200)；G～I(xiàn).各組大鼠子宮內(nèi)膜Masson染色(×400)；J～L：各組大鼠子宮內(nèi)膜CD31免疫組化染色(×400)；M.各組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖；N.各組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積比的統(tǒng)計(jì)圖；O.各組大鼠子宮內(nèi)膜CD31表達(dá)情況的統(tǒng)計(jì)圖。*P<0.05，**P<0.01

3.各組大鼠子宮組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白(GRP78、CHOP)及PI3K/Akt和ERK1/2通道相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：與對照組比較，模型組大鼠子宮組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白(GRP78和CHOP)表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而17β-雌二醇治療后其表達(dá)有所降低(P<0.05)。在模型組中，子宮內(nèi)膜組織磷酸化的Akt和ERK表達(dá)水平較對照組顯著下降(P<0.01)，而給予17β-雌二醇治療后，p-Akt和p-ERK的下降情況有所逆轉(zhuǎn)(P<0.05，圖3)。

圖3 各組大鼠子宮組織中蛋白的表達(dá)A.各組大鼠子宮蛋白表達(dá)情況；B.各組大鼠子宮GRP78和CHOP蛋白相對表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析圖；C.各組大鼠Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白相對表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析圖。與對照組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

研究表明，使用生理劑量的雌激素治療宮腔粘連有利于子宮內(nèi)膜的損傷修復(fù)[8，9]。Jolinda等[10]研究認(rèn)為，無論患者IUA程度如何，雌激素都是有效的，建議復(fù)發(fā)性IUA患者常規(guī)使用雌激素作為圍術(shù)期的輔助治療。本研究中HE及Masson染色結(jié)果顯示，治療組與模型組比較，子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量明顯增加，而子宮內(nèi)膜纖維化面積明顯減少。CD31免疫組化結(jié)果顯示治療組的微血管數(shù)量明顯增加，表明17β-雌二醇對子宮內(nèi)膜損傷有著明顯的改善作用。

近年來，越來越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究證實(shí)，大鼠脊髓損傷后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，包括GRP78和CHOP都明顯增加[11]。一項(xiàng)關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的研究也表明，冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)[12]。也有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝臟纖維化呈明顯的相關(guān)性[13，14]。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在IUA的發(fā)生、發(fā)展中的作用目前還較少被深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與了IUA的發(fā)生，相關(guān)凋亡蛋白的水平在模型組大鼠中顯著增加。而給予17β-雌二醇治療可以抑制相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，減少損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生。

PI3K/Akt和ERK1/2通路作為E2激活的主要下游信號(hào)通路，在許多細(xì)胞的生理過程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增殖和遷移以及組織的纖維化[15～17]。其中，PI3K/Akt信號(hào)通路在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[18]。PI3K可使其下游靶蛋白Akt發(fā)生磷酸化，進(jìn)而使糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，因而喪失誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；同時(shí)p-Akt還可以抑制促凋亡蛋白的合成，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[1,19]。研究表明，低劑量E2可以激活大鼠海馬的PI3K/Akt和ERK1/2通路，使磷酸化的Akt和ERK的表達(dá)顯著升高，從而促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活[20]。本研究中IUA大鼠子宮組織中p-Akt和p-ERK較對照組均顯著下降，而下降的p-Akt和p-ERK在給予17β-雌二醇治療后表達(dá)有所上升，提示在IUA中PI3K/Akt和ERK信號(hào)通路被抑制，而E2可以激活大鼠子宮內(nèi)膜的PI3K/Akt和ERK通路。

綜上所述，本研究通過建立SD大鼠機(jī)械損傷宮腔粘連模型，驗(yàn)證了17β-雌二醇能促進(jìn)子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)修復(fù)，從而起到治療作用。本研究證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和PI3K/Akt、ERK1/2通路與子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)均呈顯著的相關(guān)性，但二者之間的關(guān)系尚不明確，其具體的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。