孫忠輝， 張國龍， 王秀麗

（1.上海市奉賢區(qū)皮膚病防治所，上海 201408；2. 同濟大學醫(yī)學院光醫(yī)學研究所/上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443）

皮膚鱗狀細胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）屬最常見的皮膚惡性腫瘤之一，好發(fā)年齡50～60歲，可發(fā)生于體表的任何部位，常在癌前病變光線性角化病的基礎上發(fā)生。cSCC起源于表皮或毛囊附屬器角質(zhì)形成細胞。眾多惡性腫瘤中存在腫瘤干細胞（Cancer stem cells，CSCs），已被得到證實。惡性腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復發(fā)，CSCs對其都有影響，當前針對 CSCs的靶向治療已成為一種有前途的惡性腫瘤干預策略。用于cSCC靶向治療的臨床藥物還不多，對CSCs的研究有助于這些藥物的開發(fā)。cSCC腫瘤干細胞與表皮干細胞（Epidermal stem cells，ESCs）有一定的相似性，發(fā)現(xiàn)兩者的差異性標記物，從而進一步明確兩者信號通路的差別，可以為開發(fā)靶向藥物奠定基礎。本文綜述目前cSCC中腫瘤干細胞的起源、特性和其標記物的研究進展。

1 皮膚鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞的起源

干細胞能在一定條件下無限自我更新與分化增殖，產(chǎn)生表型與基因型和其同樣的子代細胞，其具有多向分化潛能。目前證實在皮膚中干細胞有表皮干細胞、黑色素干細胞、真皮間充質(zhì)多能干細胞、內(nèi)皮干細胞和造血干細胞等5 種成體干細胞。這些細胞可產(chǎn)生相應細胞譜系，最終發(fā)育并形成完整的皮膚。ESCs又稱上皮干細胞，是一種成體組織干細胞，包括毛囊間表皮（Interfollicular epidermis，IFE）、皮脂腺基底（Base of the sebaceous gland，BSG）和毛囊膨突部（Bulge of hair follicles，文獻習慣用毛囊干細胞HFs簡寫）干細胞，它們具有祖細胞作用，有自我更新能力和高度增殖能力。毛囊膨突部細胞是多能干細胞，通常其產(chǎn)生毛囊，但在皮膚損傷時可分化再生為表皮和皮脂腺細胞［1］。

腫瘤組織內(nèi)很大部分是只有增殖能力的腫瘤細胞，而腫瘤干細胞雖然僅一小部分，但能形成新的腫瘤克隆。它是慢細胞周期和永生化的起源驅(qū)動細胞，具有自我更新和分化能力。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)往往是由于CSCs沒有被完全消滅［2］。腫瘤細胞通常是正常細胞經(jīng)歷4 ～7 次突變后形成。占表皮大多數(shù)的角質(zhì)形成細胞如持續(xù)暴露在紫外線（Ultraviolet，UV ）、化學致癌物和人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染等環(huán)境中，獲得致癌突變的能力會增高。在表皮，大多數(shù)獲得突變的細胞都是在正常分化過程的終末中出現(xiàn)，而腫瘤的發(fā)展通常需要不止一次突變，因而皮膚腫瘤的發(fā)生相對較少。CSCs和正常干細胞具有部分相似的生物學特性。皮膚表皮中的CSCs來源于表皮干細胞（Epidermal stem cells，ESCs）［1］，ESCs也需要經(jīng)歷突變才能成為CSCs。ESCs具有形成腫瘤的能力，但是在致突變后克隆擴增的驅(qū)動因素出現(xiàn)前，它們盡管可能攜帶這些突變卻在表型上一直是正常的。相較正常表皮干細胞，此階段的ESCs及其子代具有明顯異質(zhì)性，它們具有更長的細胞周期，更強的修復能力，但是顯然它們的癌變趨勢明顯增強［3］。

現(xiàn)有研究［4］證實，cSCC的起源細胞為表皮干細胞。二甲苯蒽（DMBA）/ 十四烷醋酸佛波醇（TPA）是一種常用的致cSCC的物質(zhì)。研究［5］發(fā)現(xiàn)在DMBA治療1年后給予TPA的小鼠與在DMBA治療后立即暴露于TPA的小鼠相似，都會發(fā)生癌癥；無論何時給予TPA，腫瘤潛伏期都非常短。該研究表明cSCC中DMBA誘導的腫瘤干細胞是長壽命、慢循環(huán)的細胞，cSCC起源于表皮干細胞（ESCs），也就是毛囊間表皮干細胞（IFE）和毛囊膨突部細胞（HFs），因此cSCC中的CSCs也被認為起源于ESCs。然而僅獲得干細胞特征還不足以導致這些ESCs惡性轉(zhuǎn)化，研究表明特定類型或部位的細胞發(fā)生突變更為重要［5］。例如，HFs干細胞中如出現(xiàn)Harvey-Ras（H-Ras）表達通常具有高惡變能力，但當這種突變在IFE表皮干細胞中出現(xiàn)時，病變很少是惡性的，只有良性腫瘤生長（乳頭狀瘤形式）。這表明IFE起源的惡性腫瘤生長與其他促進因素的持續(xù)影響有關(guān)，而與H-Ras是否激活無關(guān)。cSCC長期以來被認為只是起源于HFs，但目前研究證明CSCs也可以來自IFE。維持完整的HFs 表皮干細胞，同時去除IFE 表皮干細胞，形成良性瘤和cSCC的能力都會降低。HFs突變成cSCC的能力降低表明cSCC起源細胞不僅來自HFs，也存在于IFE中［1］。

2 皮膚鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞的可塑性和異質(zhì)性

CSCs的可塑性（Plasticity）是指其具有轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N不同類型細胞的能力，而異質(zhì)性（Heterogeneity）是指其子代與親代及不同子代之間，表型或基因型方面的差異性。由于大多數(shù)惡性腫瘤含有以上特征的CSCs，因而這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)機制非常復雜，同時也造成了治療的難度。

正常干細胞（SCs）定植在專門的微環(huán)境中，即所謂的壁龕（Niche）。外部信號可以調(diào)節(jié)干細胞狀態(tài)及其后代的生物特性。在cSCC，皮膚由于長期暴露于紫外線、化學物或者HPV感染，在特定的調(diào)節(jié)信號表達或癌基因的激活參與下，SCs可轉(zhuǎn)化為CSCs［6］。這種可塑性變化與微環(huán)境中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)。例如，毛囊膨突部干細胞（HFs）可以在Kras G12D表達和腫瘤抑制因子Tp53功能喪失時充當cSCC的起源腫瘤細胞。而環(huán)氧合酶-2（Cox-2）可以調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，能介導間充質(zhì)樣梭形細胞cSCC（預后較差的cSCC，鱗狀細胞分化特征基本喪失）的形成。學者研究［7］利用工具鼠krt 15-crePR+ 在HFs中使癌基因Ras/Tp53相應表達誘導產(chǎn)生具有間充質(zhì)特征的cSCC形成，然后下調(diào)并抑制Cox-2的功能，結(jié)果顯示HFs來源的腫瘤間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征明顯減少，而且腫瘤逐漸轉(zhuǎn)化為具有上皮特征，向良性轉(zhuǎn)化。

間充質(zhì)細胞表型的獲得使惡性腫瘤細胞容易侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT激活的過程涉及到一定的細胞因子和信號分子［8］。目前認為，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是最重要的因子之一。cSCC侵襲進展過程中，CSCs能與腫瘤微環(huán)境相互作用。TGF-β上調(diào)引起CSCs釋放IL-33作為信號，促進微環(huán)境募集ST2+造血祖細胞分化為FcεRIα+的巨噬細胞。FcεRIα+巨噬細胞又會釋放TGF-β，由此產(chǎn)生富含TGF-β的微環(huán)境，激活TGF-β信號，進一步釋放CSCs相關(guān)功能，如NRF2介導的抗氧化反應［9］，促進cSCC發(fā)展。

腫瘤都存在異質(zhì)性，CSCs導致cSCC中的異質(zhì)性與所涉及的特定癌基因有關(guān)。過渡擴充細胞（Transit-amplifying cell，TACs）是一種中間體，其介于干細胞和完全分化細胞之間。正常情況下，具有譜系限制性的TACs子代缺乏產(chǎn)生腫瘤，甚至良性乳頭狀瘤的能力。HFs中，對KrasG12D突變的反應是角質(zhì)形成細胞過度增殖和去分化（乳頭狀瘤形式）。有研究表明盡管上游信號通路MAPK和AKT-S6表達均增加，但攜帶KrasG12D的TACs細胞表型依然能保持正常［10］。TACs細胞無異常表型可能是由于突變癌基因表達不足，從而未能啟動腫瘤發(fā)生。另一項研究中，同樣攜帶krasG12D 的HFs，在缺乏腫瘤抑制基因TP53的保護下，可發(fā)生cSCC。而且TP53如出現(xiàn)R172H突變和基因拷貝數(shù)改變會預后更差［11］。這些結(jié)果表明，特定癌基因或抑癌基因的激活和抑制決定了腫瘤的發(fā)生，并且可以出現(xiàn)在祖細胞、終末分化干細胞或低分化的TACs細胞中。因此，臨床cSCC中腫瘤的不同分化狀態(tài)可能與CSCs被特定基因如何激活有關(guān)。

原發(fā)的表皮腫瘤都起源于CSCs，然而特定基因突變的發(fā)生在不同情況下又可產(chǎn)生不同的腫瘤表型。角蛋白15（K15）是毛囊膨突干細胞的標志物。利用其 K15+小鼠模型，Kras的G12D突變可引發(fā)良性乳頭狀瘤，但再在DMBA誘導下可引發(fā)cSCC［12］。KrasG12D突變合并Smad4缺失不僅可以導致該模型鼠的轉(zhuǎn)移性cSCC，而且還產(chǎn)生其他腫瘤，如基底細胞癌、毛發(fā)上皮瘤和皮脂腺瘤［13］?；准毎┖蚦SCC的CSCs都起源于表皮IFE和HFs，它們不同表型的引起顯然與某些特定基因差異表達有關(guān)。近期有研究［14］表明基底細胞癌特異性基因（如GLI2、PTCH1/ 2、FZD7），在基底細胞癌細胞中高表達，但在cSCC中卻下調(diào)。顯然以上基因的表達在cSCC是抑癌因素，在基底細胞癌細胞中則是促癌因素。

3 皮膚鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞標志物及調(diào)控因子

目前，皮膚干細胞標記物包括CD34、CD44、ABC家族成員、CDl33、整合素、P63、CD20、角蛋白15、角蛋白17和角蛋白19等。cSCC中皮膚CSCs與皮膚干細胞有一定的相似性，以上標記物部分已被證實與皮膚鱗癌有關(guān)，比如CDl33［15］。但兩者之間有何明確的區(qū)別目前還不清楚，需要進一步研究發(fā)現(xiàn)兩者的差異性標記。明確兩者信號通路的差異，選擇性殺傷皮膚腫瘤干細胞，避免損傷皮膚干細胞，對腫瘤的治療尤為重要［16］。

近期，在研究cSCC時發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞中一些與分類和發(fā)病有關(guān)的標志物，這些標志物備受人們的關(guān)注。①CD133 ： cSCC腫瘤干細胞的表面標記物中最早可以作為分類標志。Patel等［15］研究癌癥起始細胞（CIC）向皮膚腫瘤干細胞（CSC）轉(zhuǎn)化時，首先采用基于CD133是否表達的cSCC細胞系簡單分類，證明在異種移植模型中CD133陽性的CICs中含有異質(zhì)性cSCC，而CD133陰性細胞不能維持cSCC繼續(xù)發(fā)展［18］。除了細胞表面標記物，cSCC腫瘤干細胞還可以根據(jù)醛脫氫酶（ALDH）和ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性進行分類。②Survivin： Lotti等［17］最早提出表皮干細胞是皮膚腫瘤起源細胞。他們研究了皮膚干細胞的標志物Survivin在cSCC展中的作用。siRNA敲除Survivin后減少了細胞克隆形成和細胞存活率，侵襲性降低。正常角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)染致癌RAS逆轉(zhuǎn)錄 Q病毒和加入NF-κB抑制劑IκBαM可促進Survivin的表達。但是這些細胞中敲除Survivin雖然可以減少增殖，但不能阻止異種移植模型中腫瘤的形成，只會延緩它們的發(fā)展。③SOX2 ： Siegle等［18］比較了小鼠cSCC的癌癥起始細胞（Cancer initiating cells，CIC）、HFs干細胞和表皮祖細胞中的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)它們表達最顯著的是SOX2。通過免疫染色，證實SOX2在正常皮膚樣本中缺失，只在cSCC中存在。SOX2在腫瘤/間質(zhì)交界處的未分化細胞中表達，這些細胞來源于CSC微環(huán)境。SOX2基因敲除顯示腫瘤生長減少，表明SOX2在cSCC的發(fā)展中起促癌作用。研究還顯示SOX2從AK到cSCC譜系發(fā)展中表達均增加。④FRMD4A：有學者在鑒定IFE表皮干細胞時，發(fā)現(xiàn)FRMD4A是一個新的腫瘤干細胞標志物［19］。通過Q-PCR對cSCC細胞上的14個表皮干細胞標記物進行檢測，證實FRMD4A是唯一一個在cSCC中持續(xù)上調(diào)明顯的基因［20］。它的表達為探索正常干細胞和腫瘤干細胞標記物之間的關(guān)系提供了一種手段。FRMD4A可調(diào)節(jié)細胞間粘附并維持正常細胞中E-鈣粘蛋白（E-cad）的表達；在體外和體內(nèi)的異種移植模型中，人cSCC細胞系中FRMD4A的敲除降低了腫瘤細胞的克隆形成效率和生長潛力。從機制上講，F(xiàn)RMD4A的表達降低調(diào)節(jié)了Hippo通路，該通路與組織生長和癌癥發(fā)展控制有關(guān)［21］。⑤Lrig1： 它是IFE表皮內(nèi)的干細胞標志物和EGFR的拮抗劑。在cSCC中，Lrig1陽性干細胞群中炎癥可以引起癌變。炎癥因子IL-17R能夠動員Lrig1陽性的干細胞增多從而影響傷口愈合和腫瘤發(fā)生。IL-17R可以影響EGFR通路，Lrig1能夠起到腫瘤抑制因子作用［22］。⑥Lgr5是Wnt靶基因，腸上皮和毛囊的干細胞標記物。在小鼠模型可發(fā)現(xiàn)在毛囊干細胞“壁龕”中的慢循環(huán)細胞中表達。移植和譜系追蹤實驗表明，這些lgr5陽性細胞在很長一段時間內(nèi)保持了毛囊的所有標志物，并可以構(gòu)建整個新的毛囊。最近，已有研究表明Lgr5在cSCC中表達上調(diào)，可作為腫瘤干細胞標記物［23］。

以上是目前明確的皮膚干細胞標志物，也是腫瘤干細胞的標志物。它們的陽性表達可以區(qū)分出腫瘤干細胞。但它們并不精確，例如，CD133陽性細胞并不都是腫瘤干細胞，在非干細胞/祖細胞和非癌細胞中也可以檢測到ALDH活性增加。

另外，調(diào)控皮膚 cSCC 中腫瘤干細胞生長的因子還有① TGF-β可以促進cSCC化療耐藥；② BMI1：與腫瘤自我更新和腫瘤發(fā)生有關(guān)；③ YAP1是Hippo 通路的關(guān)鍵下游效應器，影響正常表皮和 cSCC 中干細胞的生長；④ Grhl3是保守的發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子，與表皮分化、屏障形成有關(guān)，cSCC的發(fā)生起至關(guān)重要作用；⑤ TARC（CCL17）驅(qū)動Grhl3 缺失模型中腫瘤細胞過度增殖；⑥ miR-204 的缺失在曬傷中驅(qū)動 STAT3 促炎反應導致 cSCC 的發(fā)展；⑦ MEK1過度表達會促進過度增殖和皮膚炎癥，導致乳頭狀瘤形成［24］。

4 結(jié)語

cSCC具有侵襲性并可向遠處轉(zhuǎn)移，晚期、轉(zhuǎn)移性和免疫低下的患者非常適合生物治療（包括靶向和生物治療）。目前，在臨床開展成熟的主要藥物有EGFR抑制劑和免疫檢查點抑制劑，遠不能滿足精準治療的需求。幾乎所有惡性腫瘤都存在CSCs，其存在往往導致腫瘤易侵襲、易復發(fā)和治療抵抗。因此針對腫瘤干細胞治療將更加具有目的性，更加精準，臨床患者也將獲益更大。腫瘤干細胞的治療策略主要有靶向CSCs標志物、調(diào)節(jié)因子及相關(guān)異常信號通路［2］，靶抗原的特異性是成功根除CSCs和防止腫瘤復發(fā)的關(guān)鍵。盡管上文提到了多個在cSCC的CSCs標志物，但由于cSCC是一種高突變負擔的腫瘤，就目前來說，以上所及并不是非常特異。但是，隨著研究的深入，相信未來會必將出現(xiàn)特異、敏感的cSCC的CSCs標志物或調(diào)節(jié)因子，隨之也產(chǎn)生相應的藥物去治愈cSCC。