楊 卓 熊 輝 沈 浮 袁 博 方 萍 齊新宇 段建輝 賀淵哲

(1 常德市第一中醫(yī)醫(yī)院，常德，415000； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410208； 3 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙，410007)

股骨頸骨折(Femoral Neck Fracture)是臨床常見的骨科疾病，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展和交通意外增加，股骨頸骨折發(fā)生率正逐年攀升，骨折延遲愈合和不愈合是骨科醫(yī)師面臨極具挑戰(zhàn)性的臨床問題[1-2]。目前，股骨頸骨折占成年骨折的3.6%，好發(fā)于中老年人群[3]。臨床常根據(jù)Garden分型按骨折的移位程度分為4度，Ⅰ型為不完全骨折，Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型均為完全骨折[4-5]。對于GardenⅠ型和Ⅱ型的骨折患者可采用保守治療或閉合復(fù)位內(nèi)固定術(shù)，而GardenⅢ、Ⅳ型股骨頸骨折的老年患者常采用髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[6-7]。

目前，股骨頸骨折的療效已明顯提高，但骨折不愈合發(fā)生率和股骨頭壞死發(fā)生率仍較高，如何促進(jìn)骨折愈合、避免股骨頭壞死依然是臨床醫(yī)師面臨的重要難題。中醫(yī)藥對于促進(jìn)骨折修復(fù)有著獨(dú)特優(yōu)勢[8-11]，根據(jù)中醫(yī)理論體系采用三期辨證論治用藥，對促進(jìn)骨折愈合和損傷修復(fù)起到重要作用。骨折初期主要治以活血化瘀，桃紅四物湯源自于《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、白芍、熟地黃、川芎6味藥組成，是中醫(yī)骨傷科“活血祛瘀”法治療骨折初期的基本方。有研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可促進(jìn)骨痂中血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、核因子κB受體激活蛋白配體、白細(xì)胞介素-1等細(xì)胞因子的表達(dá),調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移、歸巢、定向分化[12-15]，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和延緩破骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管新生和骨折愈合。

由于桃紅四物湯的藥物組成較多，所含各類成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)相對廣泛，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)難以系統(tǒng)闡明其具體的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，集合藥理學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域知識(shí)，可有效系統(tǒng)性地從整體水平來揭示中醫(yī)藥治療股骨頸骨折的潛在作用分子機(jī)制。因此，本文將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來尋找桃紅四物湯治療股骨頸骨折的有效作用成分、核心靶點(diǎn)及發(fā)揮作用的相關(guān)通路，為臨床治療股骨頸骨折提供理論依據(jù)及中醫(yī)藥研究骨折全新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、GeneCards數(shù)據(jù)、Uniprot數(shù)據(jù)庫、STRING蛋白數(shù)據(jù)庫、Cytoscape-3.7.0(CentiScape插件)、R語言3.6.2程序(Bioconductor等數(shù)據(jù)包)。

1.2 方法

1.2.1 桃紅四物湯藥物活性成分篩選及潛在靶點(diǎn) 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18，通過篩選得到桃紅四物湯有效活性成分，以及其對應(yīng)靶點(diǎn)，再通過Uniport數(shù)據(jù)庫將作用靶點(diǎn)名來進(jìn)行數(shù)據(jù)注釋。

1.2.2 桃紅四物湯活性成分-靶點(diǎn)模型建立 通過Gene Card數(shù)據(jù)庫，將桃紅四物湯的活性成分與其治療股骨頸骨折的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape-3.7.0軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.2.3 交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)及核心靶蛋白預(yù)測 將桃紅四物湯治療股骨頸骨折的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種設(shè)置為“human”，檢索獲取到PPI關(guān)系，并導(dǎo)入到Cytoscape-3.7.0軟件進(jìn)行可視化分析，計(jì)算平均度值(Degree)的中位數(shù)，再以2倍度值的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)來篩選核心PPI靶蛋白。

1.2.4 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 進(jìn)一步分析桃紅四物湯治療股骨頸骨折的生物學(xué)過程，通過R語言3.6.2程序，利用“bioconductor”數(shù)據(jù)包來獲得信息，將桃紅四物湯涉及的靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析，根據(jù)富集基因數(shù)目得到前20條通路進(jìn)行可視化展示。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.3.1 動(dòng)物 選用50只健康的無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部實(shí)行分籠飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)房相對溫度15～25 ℃；相對濕度50%～60%。所有大鼠均飲用蒸餾水，每籠的墊料需要更換1次/2 d。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的所有操作，嚴(yán)格遵循動(dòng)物處置的相關(guān)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2020-0006。

1.3.2 藥物 實(shí)驗(yàn)所使用的桃紅四物湯需嚴(yán)格按照按《醫(yī)宗金鑒》標(biāo)準(zhǔn)來配伍組方：桃仁20 g、生地黃20 g、赤芍20 g、當(dāng)歸20 g、紅花10 g、川芎10 g(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供)。接骨七厘組采用湖南金沙的接骨七厘膠囊(每粒裝0.26 g)。

1.3.3 試劑與儀器 鼠血管內(nèi)皮生長因子試劑盒(上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，貨號：F3055-B)、鼠PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)試劑盒(上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，貨號：F3303-B)、鼠p-AKT(蛋白質(zhì)激酶B)試劑盒(上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，貨號：F40155-B)、4%多聚甲醛(寧波諾德生物科技有限公司，貨號：NDP-1001A)、水合氯醛(上海浦山化工有限公司，貨號：20151023)、光學(xué)顯微鏡(Motic公司，加拿大，型號：A210T)。

1.3.4 分組與模型制備 全部SPF級SD雄性大鼠都適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，再通過隨機(jī)數(shù)字表將50只大鼠分成5組：正常組、假手術(shù)組、模型組、接骨七厘組和桃紅四物湯組，每組10只。模型組、中藥組及陽性藥物組動(dòng)物造模采用改良的開放截骨法。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射將大鼠麻醉后，用手術(shù)刀將大鼠右大腿外側(cè)作一長約2 cm縱切口，分離皮下組織并充分暴露股骨頸；再使用骨鋸沿著右側(cè)股骨頸橫向?qū)⑵浣財(cái)?，并選擇長度合適的克氏針固定，將術(shù)肢稍被動(dòng)活動(dòng)，確認(rèn)復(fù)位成功，逐層縫合手術(shù)切口。假手術(shù)組大鼠只需要切開縫合不造模。

1.3.5 給藥方法 術(shù)后第1天，桃紅四物湯組和接骨七厘組開始實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物干預(yù)，每日需要2次灌胃干預(yù)，早晚各1次，共需要連續(xù)灌胃10 d。給藥通過計(jì)算公式換算：D鼠=D人×R鼠/R人(D為每天給藥的劑量，R為動(dòng)物與人體表面積比值系數(shù))，得出桃紅四物湯組每只大鼠每天灌胃量1.8 g，每只大鼠灌胃總量3 mL/d。接骨七厘組每只大鼠每天灌胃量18.72 mg，每只大鼠灌胃總量每日3 mL。正常組、假手術(shù)組和模型組需要予以3 mL/d的蒸餾水來灌胃，2次/d，灌胃共持續(xù)10 d。

1.3.6 檢測指標(biāo)與方法 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色及酶聯(lián)免疫吸附測定評估骨折愈合情況，使用HE染色法觀察骨痂處的組織病理形態(tài)，將脫鈣3周后的股骨樣本，使用石蠟進(jìn)行包埋，再使用石蠟切片機(jī)沿縱軸方向切片，厚度約為6 μm，通過烤干、脫蠟、染色、制作玻片標(biāo)本等一系列步驟后，使用光學(xué)顯微鏡觀察。為進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出桃紅四物湯治療股骨頸骨折相關(guān)信號通路，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清中相關(guān)蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1 桃紅四物湯活性成分 共得到桃仁的有效活性成分19個(gè)，紅花12個(gè)，川芎6個(gè)，白芍5個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，熟地黃2個(gè)。見表1。對這些活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測得到靶點(diǎn)基因238個(gè)。

表1 桃紅四物湯部分有效活性成分

2.1.2 股骨頸骨折與桃紅四物湯交集靶點(diǎn) 股骨頸骨折發(fā)生的相關(guān)作用靶點(diǎn)共2 013個(gè)，與桃紅四物湯有效活性成分的238個(gè)靶點(diǎn)相映射，最后得到交集靶點(diǎn)121個(gè)。見圖1。

圖1 桃紅四物湯與股骨頸骨折初期交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.1.3 桃紅四物湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 在有效成分節(jié)點(diǎn)排前5名(83、38、37、23、19)的是：槲皮素(MOL000098、Quercetin)、山柰酚(MOL000422、Kaempferol)、木犀草素(MOL000006、Luteolin)、黃芩素(MOL002714、Baicalein)、β-胡蘿卜素(MOL002773、Beta-carotene)。在基因靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)組，排前5名(35、21、18、15、14)的是：PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1、PGR?！盎钚猿煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖2。

2.1.4 桃紅四物湯PPI和核心靶蛋白 計(jì)算出平均度值(Degree)的中位數(shù)為17，再以2倍度值的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)來篩選核心PPI靶蛋白得到前10位的核心靶蛋白，依次是AKT1、MAPK-8、IL-6、JUN、MAPK-1、VEGFA、INS、EGFR、MTC、EGF、IL-1β、MMP-9、ESR-1。見圖3。

圖3 桃紅四物湯PPI網(wǎng)絡(luò)(A)及核心靶蛋白分布(B)

2.1.5 GO和KEGG分析 生物過程(Biological Process,BP)B分析數(shù)量較大主要是細(xì)胞對脂多糖、細(xì)菌來源分子、甾類激素、營養(yǎng)水平、氧化、活性氧等多種反應(yīng)；細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)分析可以看出靶點(diǎn)主要涉及膜筏、膜區(qū)、膜微結(jié)構(gòu)域、囊泡腔等；分子功能(Molecular Function,MF)分析主要包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、磷酸酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、核受體活性等。見圖4。

圖4 桃紅四物湯治療股骨頸骨折初期潛在靶點(diǎn)的GO分析圖

得到桃紅四物湯治療股骨頸早期相關(guān)性較大的信號通路是：KSHV信號通路、PI3K-AKT信號通路、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。見圖5。

圖5 桃紅四物湯主要活性成分治療股骨頸骨折初期相關(guān)信號通路氣泡圖

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 組織病理學(xué)結(jié)果 正常組和假手術(shù)組：骨組織均正常，骨皮質(zhì)和骨干連續(xù)沒有發(fā)生斷裂；模型組中可見少量軟骨細(xì)胞和部分肉芽組織，未見骨小梁形成；桃紅四物湯組和接骨七厘組中均可見大量軟骨細(xì)胞和肉芽組織，同時(shí)可見少量骨小梁形成。桃紅四物湯可有效加速新生骨小梁的形成，加快成骨進(jìn)程，從而有效干預(yù)骨折的早期愈合。見圖6。

圖6 術(shù)后第10天大鼠股骨病理學(xué)檢查(HE染色，×100)

2.2.2 血清檢測結(jié)果 桃紅四物湯組和接骨七厘組血清中血清PI3K和p-AKT濃度均高于模型組(P<0.05)，接骨七厘組和桃紅四物湯比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 血清PI3K和p-AKT濃度

3 討論

骨折愈合分為初期、中期、后期，即：血腫炎癥機(jī)化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期。中醫(yī)骨傷科認(rèn)為骨折愈合是一個(gè)“瘀去、新生、骨合”的過程，并提出骨折初期應(yīng)治以活血化瘀?；谥嗅t(yī)學(xué)“辨證論治”“整體觀念”結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析活血化瘀法代表方劑桃紅四物湯治療股骨頸骨折初期的具體作用分子機(jī)制，從系統(tǒng)生物學(xué)來全面分析中藥方劑中發(fā)揮治療作用的具體有效活性成分，從而為深入研究中藥治療骨折的分子機(jī)制及新藥開發(fā)提供技術(shù)支持和理論支撐。

本研究結(jié)果顯示：桃紅四物湯治療股骨頸骨折初期的有效成分主要有槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩素、β-胡蘿卜素等39種?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可防止骨質(zhì)流失，能顯著增加骨礦化和成骨能力，增加Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、骨鈣素和骨橋蛋白等特異性基因的mRNA表達(dá)水平[16]。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化，并可能通過miR-206/Cx43(間隙連接蛋白43)信號通路來調(diào)節(jié)。促進(jìn)血管新生的作用；山柰酚可以參與細(xì)胞因子的代謝，抑制細(xì)胞的凋亡和減輕缺血后再灌注損傷，其機(jī)制可能與激活PI3K-AKT信號通路相關(guān)[17]；木犀草素具有抗纖維化、抗氧化、抗炎活性，與AKT1有很強(qiáng)活性，通過抑制白細(xì)胞介素-31的產(chǎn)生來促分裂原活化的蛋白激酶、核因子κB、JJun激酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3等因子的激活[18]；黃芩素作為一種脂氧合酶可以增加骨痂的形成，對肌腱和骨具有促進(jìn)作用，可能通過激活Wnt/β-連環(huán)素信號通路促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成骨分化，從而促進(jìn)腱-骨愈合[19]；β-胡蘿卜素[20]有助于維持骨轉(zhuǎn)換的正平衡，有效抑制骨密度的降低，提高細(xì)胞質(zhì)護(hù)骨素基因的表達(dá)，保護(hù)人體的骨骼健康。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，我們得知蛋白激酶B-1、促分裂原活化的蛋白激酶-8、白細(xì)胞介素-6、Jun激酶、促分裂原活化的蛋白激酶-1、血管內(nèi)皮生長因子A、表皮生長因子受體、白細(xì)胞介素-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、雌激素受體-1等核心蛋白是治療股骨頸骨折初期的重要靶點(diǎn)。蛋白激酶B-1被磷脂酰肌醇依賴性激酶-1催化后，使結(jié)構(gòu)域中的Ser124和Thr450發(fā)生磷酸化并完全活化，從而參與調(diào)節(jié)多個(gè)下游效應(yīng)蛋白來促進(jìn)細(xì)胞血管生成參與骨折愈合過程[21]。PI3K/AKT信號通路對成骨具有調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，可能與Wnt/β-連環(huán)素通路串?dāng)_發(fā)揮成骨作用[22]。促分裂原活化的蛋白激酶是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的重要信號系統(tǒng)，包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶、JUN和p38促分裂原活化的蛋白激酶。有研究表明促分裂原活化的蛋白激酶-1和促分裂原活化的蛋白激酶-8可阻礙破骨細(xì)胞的形成，減輕骨丟失，從而促進(jìn)骨折初期的愈合[23]。白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β是炎癥介質(zhì)，在骨折初期(即血腫炎癥機(jī)化期)明顯增高，有研究表明骨髓中的肥大細(xì)胞可通過促進(jìn)破骨細(xì)胞形成(如組胺、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6)和抑制成骨細(xì)胞活性(白細(xì)胞介素-1β)來促進(jìn)骨折的愈合[24]。血管內(nèi)皮生長因子A和表皮生長因子受體均對細(xì)胞的生長增殖分化起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子可以促進(jìn)血管新生和增加血管通透性，血管內(nèi)皮生長因子A通過膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)骨化，有利于骨折初期修復(fù)過程中骨膜血管的快速生成和骨的形成[25]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，桃紅四物湯治療股骨頸初期骨折主要涉及以下相關(guān)信號通路：PI3K-AKT、核因子κB、白細(xì)胞介素-17及TNF信號通路等。PI3K/AKT信號通路分布廣泛，是細(xì)胞生長、增殖、分化的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是成骨細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。通過PI3K/AKT信號通路，骨折骨痂和小鼠成骨細(xì)胞MC3T3E1細(xì)胞中糖原合成酶激酶-3β在Ser9位發(fā)生磷酸化，并且β-連環(huán)素在Ser552位也發(fā)生了磷酸化，進(jìn)一步激活下游β-連環(huán)素，參與成骨細(xì)胞的增殖與分化，而PI3K/AKT抑制劑LY294002實(shí)質(zhì)上可以抑制骨折的愈合過程[26]。有研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞清道夫受體1介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力，并找到了其作用的靶基因是過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α。核因子κB是一類轉(zhuǎn)錄因子，對炎癥和骨重建起到重要的調(diào)節(jié)作用，起到促進(jìn)骨折初期(即血腫炎癥機(jī)化期)愈合和防治骨質(zhì)丟失的作用。有研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體激酶2相互作用蛋白1可以影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌血管生成因子，通過調(diào)節(jié)核因子κB信號通路來促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌，促進(jìn)血管生成和骨折愈合。核因子κB的激動(dòng)劑核因子κB受體激活蛋白配體蛋白可以在成骨細(xì)胞中表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，而核因子κB抑制劑BAY 11-7082能夠抑制骨折部位的前列腺素E2生物合成、堿性磷酸酶的活性以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7表達(dá)，抑制骨折的愈合。對此，本研究團(tuán)隊(duì)推測桃紅四物湯治療股骨頸骨折初期可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)和血管新生，繼而改善成骨細(xì)胞分化來促進(jìn)骨折愈合。進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分驗(yàn)證，得出桃紅四物湯通過上調(diào)血清中PI3K、p-AKT的高表達(dá)，促進(jìn)骨小梁的新生，從而有效促進(jìn)大鼠骨折模型的早期愈合。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，初步探討了桃紅四物湯治療股骨頸骨折初期的作用機(jī)制是桃紅四物湯中多種有效活性成分來調(diào)控股骨頸骨折相關(guān)基因，通過調(diào)控基因再進(jìn)一步影響多條信號通路，但具體機(jī)制的結(jié)論尚需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來挖掘中醫(yī)藥治療骨傷疾病，從分子水平預(yù)測其具體作用機(jī)制，為中醫(yī)“活血化瘀”法促進(jìn)骨折修復(fù)愈合提供了全新的思路和作用靶點(diǎn)。