韓榮嘉，梁夢(mèng)菊，翟亞軍，劉建華，彭祖焜，閆峰賓，吳 華

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

當(dāng)前畜牧業(yè)養(yǎng)殖中肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae， KPN）是僅次于大腸桿菌的第二大條件性致病菌［1］，能造成嚴(yán)重的感染和較大的經(jīng)濟(jì)損失［2］，獸醫(yī)臨床中耐藥性肺炎克雷伯菌的報(bào)道也越來(lái)越多［3］，且部分地區(qū)已有對(duì)黏菌素耐藥的肺炎克雷伯菌感染報(bào)道，增加了其感染治療的難度和復(fù)雜性。黏菌素（Colistin， COL）是有效治療革蘭氏陰性菌多肽類(lèi)抗生素藥物，因其獨(dú)特的抗菌作用機(jī)制而被用于多重耐藥菌的感染防治。但自2015年我國(guó)獸醫(yī)臨床首次報(bào)道COL耐藥以來(lái)［4］，對(duì)COL耐藥的獸醫(yī)臨床菌株報(bào)道也日益增多，這限制了COL的使用。而研發(fā)抗菌輔助藥物來(lái)降低菌株對(duì)COL的耐受力、增加COL的敏感性是當(dāng)前抗多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的主要措施之一，如與中藥組方、中藥單體、增效佐劑聯(lián)用等。

中藥方劑黃連解毒湯（Huanglian Jiedu Decoction， HJD）由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，具有抑菌、抗炎、抑制腫瘤、抗氧化且對(duì)腸道菌群具有一定的促進(jìn)作用［5］。近年來(lái)，中西藥聯(lián)用的研究不斷增加，復(fù)方劑黃連解毒湯與多種抗生素聯(lián)用表現(xiàn)出的明顯抑菌作用值得深入研究。氯硝柳胺（Niclosamide， NIC）常作為腸道驅(qū)絳蟲(chóng)藥，近年來(lái)有研究表明［6-7］：NIC與COL聯(lián)用時(shí)能增強(qiáng)耐COL革蘭氏陰性菌的敏感性，多次證明可以有效恢復(fù)碳青霉烯類(lèi)、COL類(lèi)抗生素的抗菌活性，具有逆轉(zhuǎn)多重耐藥革蘭氏陰性菌（包括COL耐藥的肺炎克雷伯菌）的潛力。

過(guò)度使用抗菌藥物及耐藥機(jī)制的橫向傳播，導(dǎo)致同時(shí)對(duì)多種抗微生物藥物耐藥的多重耐藥菌（Multi-drug resistant， MDR）越來(lái)越多。COL耐藥肺炎克雷伯菌屬于多重耐藥菌（MDR-KP），其臨床治療困難，需用新型抗菌藥物或新的聯(lián)合抗菌理論予以治療。而中藥與佐劑聯(lián)合是當(dāng)前逆轉(zhuǎn)COL耐藥的主要用藥策略之一。本研究將HJD與NIC聯(lián)合應(yīng)用，探尋了有效的抗菌佐劑來(lái)降低肺炎克雷伯菌對(duì)COL的耐藥性，或恢復(fù)COL抗革蘭氏陰性菌的敏感性，以期找到合適的中藥聯(lián)合增效佐劑及逆轉(zhuǎn)耐藥佐劑，用于人醫(yī)和獸醫(yī)臨床應(yīng)用，也為創(chuàng)新聯(lián)合用藥措施提供一些新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 依據(jù)2019版CLSI的折點(diǎn)［8］（MIC值≥4 μg/mL）判斷耐藥菌株，本試驗(yàn)選用3株耐COL的肺炎克雷伯菌KP1（豬場(chǎng)廢水分離）、KP4（豬場(chǎng)廢水分離）和KP9（人醫(yī)臨床分離），1株敏感菌株KP28（人醫(yī)臨床分離）。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基及藥品 試劑：去離子水、蒸餾水、無(wú)水乙醇、1 mol/L氫氧化鈉溶液；營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、MH（B）培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂；藥品：5120 μg/mL硫酸黏菌素（76.6%）、1 g/mL黃連解毒湯、5120 μg/mL氯硝柳胺（98%）；均購(gòu)自天馳生物公司。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫生化培養(yǎng)箱（由賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)）；無(wú)菌超凈工作臺(tái)（由蘇州安泰技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；高壓蒸汽滅菌鍋（由上海生光儀器廠生產(chǎn)）；電子分析天平（由上海菁海儀器有限公司生產(chǎn)）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（由上海益恒試驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)）；空氣搖床（由北京六一儀器廠生產(chǎn)）；移液槍、臺(tái)式低速離心機(jī)（由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)）；電磁爐（由美的集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HJD（1 g/mL）的制備 將黃連、黃芩、黃柏、梔子按照3∶2∶2∶3的比例合計(jì)稱取50 g于一定量的蒸餾水中，浸泡30 min，大火煮沸之后轉(zhuǎn)文火，煮至體積少于200 mL，經(jīng)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾后，濾渣再用500 mL蒸餾水用同樣方法，煎制一段時(shí)間后合并煎液。文火煮至50 mL，濃度即為1 g/mL。無(wú)菌藥用注射器取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾于2 mL EP管，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 單藥MIC值的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法［9］測(cè)定單藥MIC值。在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用移液槍吸取5 μL的培養(yǎng)好的菌液，加入裝有5 mL MHB肉湯的EP管中，用漩渦混勻儀混勻。測(cè)定COL、NIC單藥MIC值時(shí)采用10倍稀釋法。在每一行第1孔加入含12 μL的藥液和108 μL菌液的120 μL體系，之后每孔加入60 μL菌液，倍比稀釋至倒數(shù)第2孔。HJD采用雙倍稀釋方法，吸取50 μL的藥液加入反應(yīng)板每一行的第1孔，再往第1孔加入50 μL的菌液，之后每孔加入50 μL的菌液，倍比稀釋至倒數(shù)第2孔。密封放置于恒溫保溫箱，培養(yǎng)18 h后讀取結(jié)果。

1.2.3 兩藥聯(lián)合MIC值的測(cè)定 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)定需固定濃度的藥物梯度或者亞抑菌濃度，將藥物和MHB肉湯配制成固定濃度的體系，即5 mL藥物和MHB混合液，再向該體系中加入培養(yǎng)好的5 μL菌液，在漩渦混勻儀上混勻。按照COL單藥藥敏的方法倍比稀釋至倒數(shù)第2孔，最后一孔作為陽(yáng)性對(duì)照，密封放置于恒溫保溫箱，培養(yǎng)18 h后讀取結(jié)果。

1.2.4 用棋盤(pán)法測(cè)定部分抑菌濃度指數(shù)（FIC） 將2種藥物分別在2塊96孔無(wú)菌反應(yīng)板按照10倍稀釋或雙倍稀釋的方法，進(jìn)行12×12的棋盤(pán)法單藥倍比稀釋?zhuān)缓髮?塊反應(yīng)板的對(duì)應(yīng)孔混合均勻，并作陽(yáng)性對(duì)照。密封放置于恒溫箱，培養(yǎng)18 h后讀取結(jié)果。

1.2.5 三藥聯(lián)合測(cè)定MIC值 將1 μg/mL NIC固定到MHB中，再將不同濃度的中藥固定到MHB中，配制成5 mL體系的不同濃度中藥、NIC與MHB的混合液。然后按照COL單藥微量肉湯稀釋法進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)詈笠豢鬃鳛殛?yáng)性對(duì)照。密封放置于恒溫保溫箱，培養(yǎng)18 h后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單藥MIC值的測(cè)定結(jié)果

單藥MIC值的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，COL對(duì)KP1、KP4和KP9的單藥MIC值均為128 μg/mL，對(duì)KP28的單藥MIC值為0.5 μg/mL；NIC對(duì)4株菌的MIC值＞512 μg/mL；黃連解毒湯對(duì)4株菌的MIC值均為250 mg/mL。

表1 3種藥物對(duì)肺炎克雷伯菌的單藥MIC值

2.2 兩藥聯(lián)合MIC值的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 NIC與COL聯(lián)合的抑菌作用 本研究選用0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 μg/mL 共7個(gè)濃度的NIC與COL聯(lián)合用藥，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)NIC濃度在1~16 μg/mL之間時(shí)，與COL聯(lián)用效果較明顯；對(duì)于耐藥菌株KP1、KP4、KP9，8 μg/mL NIC與COL聯(lián)用時(shí)的效果最佳，分別能使COL的MIC值下降至原來(lái)的1/16410、1/512和1/4096；而對(duì)于敏感菌株KP28，聯(lián)用后COL的MIC值最低下降至原來(lái)的1/128。

表2 不同濃度NIC聯(lián)用COL的MIC值

2.2.2 HJD與COL聯(lián)合的抑菌作用 根據(jù)HJD對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC值，將HJD濃度固定為1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，分別與COL聯(lián)用并測(cè)定其MIC值，結(jié)果如表3所示。1/2 MIC （125000 μg/mL） HJD是與COL聯(lián)用的最佳濃度，最低能使其MIC值下降至原來(lái)的1/512；對(duì)于敏感菌株KP28,能使其MIC值下降至原來(lái)的1/8。

表3 不同濃度HJD聯(lián)合COL的MIC值

2.3 用棋盤(pán)法測(cè)定兩藥聯(lián)合的FIC指數(shù)

根據(jù)棋盤(pán)法試驗(yàn)要求［9］， FIC指數(shù)= MIC（A組聯(lián)合） /MIC（A組單藥） +MIC（B組聯(lián)合） /MIC（B組單藥）。其中， FIC≤0.5為協(xié)同作用、0.5＜FIC≤1為加性作用、1＜FIC≤2為無(wú)關(guān)作用、FIC＞2為拮抗作用。兩藥聯(lián)合的 FIC指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)于NIC與COL聯(lián)合的 FIC值，3株耐COL菌株的FIC＜0.5，兩藥表現(xiàn)為協(xié)同作用。就HJD和COL聯(lián)合的FIC值而言，菌株KP1的FIC＜0.5，兩藥表現(xiàn)為協(xié)同作用，KP4和KP9的 FIC值均為0.625，兩藥表現(xiàn)為加性作用。

表4 用棋盤(pán)法測(cè)定兩藥聯(lián)合的FIC指數(shù)

2.4 三藥聯(lián)合結(jié)果

選取1 μg/mL作為NIC的固定濃度，將NIC、COL分別與1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC這3個(gè)濃度的HJD聯(lián)合，測(cè)定試驗(yàn)菌株三藥聯(lián)合的MIC值，分析和判斷1 μg/mL NIC與HJD是否有協(xié)同作用。結(jié)果見(jiàn)表5，亞抑菌濃度的HJD加NIC與COL聯(lián)用后對(duì)菌株的MIC值均大于1 μg/mL NIC聯(lián)用COL對(duì)菌株的MIC值，初步判定HJD和NIC沒(méi)有協(xié)同增效作用，其聯(lián)合作用效果有待深入研究和進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 1 μg/mL NIC和亞濃度的HJD聯(lián)用COL的MIC值

3 討論

靜止期殺菌劑COL具有獨(dú)特的作用機(jī)制，曾作為治療革蘭氏陰性菌包括多重耐藥菌的優(yōu)勢(shì)抗生素，但其耐藥性的不斷出現(xiàn)限制了其在臨床的應(yīng)用，為其找到有效的增效佐劑或逆轉(zhuǎn)耐藥佐劑成了近幾年研究熱點(diǎn)［10-12］。

Domalaon等［7］的研究表明：NIC與COL聯(lián)用對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌效果具有協(xié)同作用，1 μg/mL NIC與COL的聯(lián)合效果最佳。而本試驗(yàn)研究表明：8 μg/mL NIC與COL聯(lián)用的效果最佳，菌株個(gè)體差異性及菌株樣本數(shù)較少可能是導(dǎo)致該結(jié)果的主要因素。研究表明，NIC能逆轉(zhuǎn)產(chǎn)碳青霉烯酶和（或）耐COL腸桿菌科細(xì)菌對(duì)COL的耐藥性且具有協(xié)同作用［13］。本研究進(jìn)一步證實(shí)了NIC在耐藥肺炎克雷伯菌菌株中的增效作用。

HJD作為中國(guó)經(jīng)典中藥組方，具有價(jià)格低廉、易獲得、療效確定、作用廣泛、藥效持久等特點(diǎn)，在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上均已得到了廣泛的應(yīng)用。高桂玲等［14］研究指出，HJD可用于難治性支原體肺炎的治療。覃偉等［15］在2021年報(bào)道中認(rèn)為HJD聯(lián)合阿奇霉素治療肛周膿腫的效果明顯。侯欣穎等［16］驗(yàn)證了長(zhǎng)期使用高劑量的HJD有類(lèi)抗生素的作用，在臨床治療細(xì)菌感染方面具有很大的潛力。此外，HJD在聯(lián)合用藥方面，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌也有很好的抑制作用，例如周芳芳等［17］在2019年的報(bào)道中認(rèn)為HJD聯(lián)合左氧氟沙星、慶大霉素后對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的抑菌效果顯著增強(qiáng)。本研究再次證實(shí)了HJD聯(lián)合COL對(duì)COL耐藥肺炎克雷伯菌具有體外抑菌增效作用，具備作為獸醫(yī)臨床聯(lián)合COL用藥較大的應(yīng)用潛力。

曾雪花等［18］研究表明，HJD對(duì)銅綠假單胞菌和大腸桿菌的MIC值＞1000 mg/mL，而本研究結(jié)果表明：HJD對(duì)肺炎克雷伯菌的MIC值為250 mg/mL，說(shuō)明HJD對(duì)不同革蘭氏陰性菌的抑菌效果存在差異。HJD與COL聯(lián)用能使耐藥菌株對(duì)COL的MIC值下降至原來(lái)的1/512，且FIC值在0.312~0.625之間，有協(xié)同和加性作用。HJD組方中黃連的主要成分小檗堿、黃芩提取物黃芩均已被證實(shí)了具有逆轉(zhuǎn)耐COL大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的作用［19-20］。本研究也證實(shí)了HJD組方具備增效或逆轉(zhuǎn)COL耐藥的潛力，但組方中藥物成分多樣復(fù)雜，發(fā)揮抑菌作用的成分可能不止一種，其是否具備更優(yōu)異的增效作用、與中藥單體存在哪些增效差異、具備什么樣的作用機(jī)制等需要進(jìn)一步深入研究。

當(dāng)COL與NIC、HJD三藥同時(shí)聯(lián)用時(shí)，COL的MIC值并沒(méi)有在兩藥聯(lián)合的基礎(chǔ)上進(jìn)一步下降，分析三藥聯(lián)合時(shí)，僅是HJD或NIC其中一種藥物發(fā)揮了體外抑菌增效作用，但二者體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)是否具備新的增效作用或增效機(jī)制，有待深入研究和探討。

為解決COL耐藥率不斷增加的問(wèn)題，COL的抗菌增效劑不斷被發(fā)現(xiàn)，如氟苯尼考、舍西林、左旋丙嗪、LpxC抑制劑Chir-090及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等［21］，此外抗菌肽MSI-78或OTD-244與COL聯(lián)用也表現(xiàn)出較好的協(xié)同效果［22］。本試驗(yàn)首次從體外研究證實(shí)了復(fù)方制劑黃連解毒湯也可作為COL的抗菌增效劑，這為臨床中西藥聯(lián)用逆轉(zhuǎn)COL耐藥提供了更多思路和方法。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯和氯硝柳胺可以有效逆轉(zhuǎn)肺炎克雷伯菌對(duì)黏菌素的耐藥性，但三藥聯(lián)合體外研究未表現(xiàn)出黃連解毒湯和氯硝柳胺的協(xié)同逆轉(zhuǎn)作用，其具體抑菌機(jī)制、體內(nèi)聯(lián)合作用及增效機(jī)制有待深入探討。