趙紅啟，楊 勇，閆 艷，范 杰，李鴻雁

(1.黃淮學(xué)院園林中心，河南 駐馬店 463000；2. 黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

【研究意義】植物生長(zhǎng)在不斷變化的自然環(huán)境條件下，受到各種生物和非生物脅迫。為了提高生存率，植物必須通過進(jìn)化和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)機(jī)制來適應(yīng)這些惡劣的環(huán)境。作為主要的非生物脅迫，干旱是對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不利影響，甚至對(duì)農(nóng)業(yè)產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失的重要環(huán)境脅迫因子之一。因此，研究與植物抗逆性相關(guān)的基因及其分子機(jī)制，對(duì)于植物抗逆力的遺傳改良和人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控機(jī)制中扮演著十分重要的角色，近幾年備受關(guān)注。克隆WRKY相關(guān)基因，研究其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于闡明植物轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)是脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶基因表達(dá)的重要介質(zhì)。TFs通過調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)水平，在保護(hù)機(jī)體免受應(yīng)激相關(guān)損傷中發(fā)揮重要作用[1-2]。大量研究表明，TFs基因的過表達(dá)激活了一組靶基因，這些靶基因協(xié)同抵御非生物脅迫的不利影響。因此，TFs基因工程是提高作物抗逆性的有效途徑。擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組中有1500多個(gè)TFs，約占所有基因的6%[3]。在這些TFs中，WRKY作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用4]。WRKY蛋白是一種新型的植物鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其N端含有7個(gè)由WRKYGQK組成的氨基酸序列。WRKY蛋白是由1個(gè)或2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域。WRKY-TF基因受生物和非生物脅迫誘導(dǎo)，參與植物脅迫響應(yīng)[5]。WRKY-TFs是植物基因組中的一個(gè)大基因家族。擬南芥中有74個(gè)基因[4]，水稻(OryzasativaL.)中有100多個(gè)基因[6]，小麥(TriticumaestivumL.)中有119個(gè)基因[7]，小白菜(BrassicacampestrisL.)中有46個(gè)基因[4]。WRKYs被認(rèn)為是參與生物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵TFs，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為WRKY調(diào)控非生物脅迫響應(yīng)提供了證據(jù)。此外，一些TFs對(duì)干旱脅迫特別敏感。例如，金錢草(DichondrarepensL)WRKY70基因通過調(diào)控精氨酸脫羧酶基因在抗旱和腐胺合成中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)的BdWRKY36基因?qū)Ω珊得{迫的耐受性顯著增強(qiáng)[8]。另外2個(gè)WRKY基因(ABO3和ThWRKY4)已被證明是干旱脅迫響應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)控基因[9]。MuWRKY3基因在花生(ArachishypogaeaL.)中的過表達(dá)是通過減少M(fèi)DA、過氧化氫和超氧陰離子的積累以及增加脯氨酸含量、可溶性糖含量和抗氧化的活性顯著提高花生的耐旱性[10]。雖然一些TFs在模式植物中具有生理功能，但大多數(shù)TFs的功能尚不清楚，特別是在羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.acephalaDC)等非模式植物中。【本研究切入點(diǎn)】WRKY家族基因在植物抗旱育種中具有廣泛的應(yīng)用前景，前期在擬南芥、小白菜和油菜(BrassicacampestrisL.)等十字花科中發(fā)現(xiàn)一些WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因在植物逆境中起重要作用，但在羽衣甘藍(lán)中鮮有研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以羽衣甘藍(lán)為材料，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)探究BoWRKY10基因在羽衣甘藍(lán)耐旱性中的生物學(xué)功能。探明在羽衣甘藍(lán)中超表達(dá)BoWRKY10對(duì)羽衣甘藍(lán)抗旱性的影響，明確該基因在羽衣甘藍(lán)響應(yīng)干旱脅迫的生物學(xué)功能其在旱育種中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羽衣甘藍(lán)種質(zhì)材料“葉牡丹”由黃淮學(xué)院園林中心提供。煙草NC89及pCAMBIA1301載體由黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。植物在溫室中用混合營(yíng)養(yǎng)土[m(蛭石)：m(營(yíng)養(yǎng)土)=1∶1]培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24 ℃/22 ℃(白天/黑夜)，濕度為65%，光照周期為光照(L):黑暗(D)=16 h:8 h。

1.2 RNA提取與載體構(gòu)建

用植物總RNA分離試劑盒(TaKaRa，大連，中國(guó))從羽衣甘藍(lán)的葉片中提取總RNA。根據(jù)試劑盒的說明，使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(TaKaRa，大連，中國(guó))合成第一鏈cDNA。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得羽衣甘藍(lán)WRKY10基因序列，利用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)了特異的正向和反向引物(表1)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化后，被克隆到pMD18-T載體( TaKaRa，大連，中國(guó))上并測(cè)序。

1.3 煙草轉(zhuǎn)化與篩選

把測(cè)序后正確的序列與含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Neomycin phosphotransferase gene, NPTII)和35S啟動(dòng)子(CAMV35S)的pCAMBIA1301雙元載體相連。將pCAMBIA-BoWRKY10導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。根據(jù)Horsch等[11]的方法轉(zhuǎn)化煙草。將T0轉(zhuǎn)基因植株的種子收獲并接種在含有卡那霉素(100 mg/L)的MS培養(yǎng)基上。用qPCR引物擴(kuò)增BoWRKY10基因(表1)。采用定量PCR(qPCR)技術(shù)檢測(cè)BoWRKY10在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取適量野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草種子于無菌2 mL離心管中，70%酒精消毒30 s，無菌水洗1次，10%(v/v)H2O225 ℃消毒 10 min，無菌水洗5～6次，點(diǎn)播于含有15% PEG4000的 1/2 MS培養(yǎng)基上，黑暗1 d后，28 ℃光照培養(yǎng)，每隔24 h 統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率；正常萌發(fā)的種子移栽到 5%、10%和15% PEG4000的1/2 MS條件14 d后，統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)，每個(gè)株系取12株；煙草于溫室培養(yǎng)30 d后，15% PEG4000處理，24 h后取材料檢測(cè) BoWRKY10和相關(guān)脅迫響應(yīng)因子的表達(dá)量，1周后測(cè)定SOD、POD、CAT活性和H2O2含量，每個(gè)株系取8株。在抗旱性試驗(yàn)中，每個(gè)株系取生長(zhǎng)相似的5周齡植物30株，停止?jié)菜?4 d后復(fù)水，計(jì)算存活率。在干旱第7天時(shí)，取樣測(cè)定H2O2含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性和相對(duì)含水量(RWC)、丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性糖含量。所有測(cè)定按李玲的方法[12]進(jìn)行。每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

表1 引物序列及用途

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR在煙草中的表達(dá)分析

用TRIzol試劑提取總RNA，取2 μg RNA合成cDNA。以表1所列的序列為引物，cDNA 為模板，用ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI，F(xiàn)oster City，CA，USA)進(jìn)行qPCR，3次重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃10 s，94 ℃10 s，60 ℃25 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt算法分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2016和SPSS 17.0中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并從3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為是差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoWRKY10基因轉(zhuǎn)化煙草及陽性植株篩選

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建pBIA-35S-BoWRKY10植物表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到煙草中，100 mg/mL Kan培養(yǎng)基上篩選出長(zhǎng)勢(shì)較好的煙草進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因煙草中檢測(cè)到9個(gè)陽性株系。野生型煙草葉片中沒有檢測(cè)到目的條帶。qRT-PCR分析表明，9個(gè)株系BoWRKY10基因均能過表達(dá)，但OE-3、OE-4和OE-6表達(dá)量較高(圖1)。因此，以下研究選取這3個(gè)株系作為研究材料。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱的耐受性分析

為研究外源BoWRKY10基因表達(dá)對(duì)植物干旱脅迫響應(yīng)的影響，選擇相對(duì)表達(dá)量較高的OE-3、OE-4 和OE-6轉(zhuǎn)基因煙草T2代株系進(jìn)行耐旱性分析，結(jié)果(圖2-A)顯示，轉(zhuǎn)BoWRKY10基因的煙草比WT對(duì)干旱處理產(chǎn)生了一定的耐性。對(duì)5周齡的轉(zhuǎn)基因植株和野生植株進(jìn)行干旱處理, 干旱處理14 d后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉只有少許萎焉，而野生型煙草完全萎焉，復(fù)水后轉(zhuǎn)基因株系恢復(fù)較好，轉(zhuǎn)基因株系OE-3、OE-4 和OE-6存活率分別為60.6%、63.3%和61.0%，而野生型對(duì)照存活率僅為22.2%，轉(zhuǎn)基因株系存活率顯著高于野生型對(duì)照(圖2-B) 。

2.3 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)率及根長(zhǎng)

種子在含15% PEG4000 1/2 MS培養(yǎng)基中萌發(fā)14 d后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系主根長(zhǎng)顯著大于野生型 (圖3-A，3-B)。在正常1/2 MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系OE-3、OE-4 和OE-6的發(fā)芽率和野生型對(duì)照沒有明顯差異(圖3-C)；而15%PEG4000培養(yǎng)基中，OE-3、OE-4 和OE-6萌發(fā)率分別為65.9%、75.4%和84.3%，野生型僅為22.5%(圖3-D)；與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)率分別提高了43.4%、52.9%和 61.8%(圖3-D)。

*表示與對(duì)照有顯著差異(P<0.05),下同* denotes significant differences as compared with the control group(P<0.05), the same as below圖1 轉(zhuǎn)基因煙草中BoWRKY10基因過表達(dá)分析Fig.1 Overexpression analysis of BoWRKY10 gene in transgenic tobacco

圖2 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的表型和存活率Fig.2 Phenotype and survival rate of transgenic tobacco under drought stress

2.4 干旱脅迫下BoWRKY10過表達(dá)對(duì)煙草生理特性的影響

轉(zhuǎn)基因植株與野生型(WT)植株在處理前脯氨酸和MDA含量差異不顯著。干旱脅迫后，轉(zhuǎn)BoWRKY10基因植株和WT植株的脯氨酸和MDA含量增加，且轉(zhuǎn)BoWRKY10基因植株的脯氨酸含量顯著高于WT植株(圖4)。相比之下，轉(zhuǎn)基因BoWRKY10株系的MDA含量顯著降低。在干旱脅迫后，BoWRKY10轉(zhuǎn)基因植株和WT植株的可溶性糖含量增加，但BoWRKY10轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖含量顯著高于WT植株。干旱處理7 d后，BoWRKY10過表達(dá)株系的RWC顯著高于WT。

干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片中SOD、POD、CAT活性顯著高于對(duì)照，而轉(zhuǎn)基因植株中的H2O2水平較低(圖5)。此外，在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周的幼苗，移栽到含PEG4000(mol/L，15%)的MS培養(yǎng)基上1周，檢測(cè)結(jié)果與干旱脅迫結(jié)果相似。表明，在干旱脅迫下，BoWRKY10的表達(dá)通過增加3種重要抗氧化酶的活性影響ROS水平。

圖3 不同脅迫條件下過表達(dá)BoWRKY10基因煙草植株的根長(zhǎng)和萌發(fā)率Fig.3 Root length and germination rate of tobacco plants overexpressing the BoWRKY10 gene under different stress conditions

**表示與對(duì)照有極顯著差異(P<0.01)，下同** denotes significant differences as compared with the control group (P<0.01), the same as below圖5 正常和干旱滲透脅迫條件下野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草中抗氧化酶活性和H2O2積累Fig.5 Three antioxidant enzyme activities and H2O2 accumulation in WT and transgenic tobacco under normal and drought/osmotic conditions

2.5 BoWRKY10調(diào)節(jié)干旱脅迫下應(yīng)答基因的表達(dá)

以2周齡對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草(OE-3)植株為材料，PEG4000(m/mol/L，15%)處理1周，NtSOD、NtAPX、NtCAT、NtGST、NtSPSAt和NtNCED1等6個(gè)ROS相關(guān)的脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)。與對(duì)照植物相比，當(dāng)用PEG4000時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物中所檢測(cè)的應(yīng)答基因均顯著上調(diào)(圖6)，表明BoWRKY10在煙草中的表達(dá)通過誘導(dǎo)一些ROS相關(guān)基因和脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了煙草的抗旱性。

圖6 干旱處理下野生型(WT)和 BoWRKY10轉(zhuǎn)基因煙草脅迫響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)Fig.6 Expression of stress response genes in WT and BoWRKY10 transgenic tobacco under drought conditions

3 討 論

WRKY-TFs是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族之一，具有多種功能環(huán)境脅迫下的發(fā)育和生理功能。近年來，在水稻[6]、大豆[13]、棉花[14]、短梗草[8]、玉米[15]和小麥[7]等植物中發(fā)現(xiàn)了大量的WRKY蛋白。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同的脅迫環(huán)境均有應(yīng)答。已有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TaWRKY46增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的滲透脅迫耐受性，其轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在含甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基中具有較高的發(fā)芽率和較長(zhǎng)的主根[7]。番茄SlWRKY39是擬南芥AtWRKY40的同源基因，它能被鹽、干旱及ABA等相關(guān)脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá)[16]。但Liu等[17]對(duì)棉花研究表明，轉(zhuǎn)基因植株中GhWRKY25的過表達(dá)降低了抗旱性。本研究表明，當(dāng)把羽衣甘藍(lán)的BoWRKY10基因克隆到煙草中，其過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性；在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)、發(fā)芽率及存活率均顯著高于野生型。

在干旱脅迫下，ROS的過量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致氧化損傷，通過激活活性氧清除酶進(jìn)行解毒[18-19]。MDA濃度是膜脂過氧化的一個(gè)參數(shù)，反映了響應(yīng)程度。因此，丙二醛含量通常被用作非生物脅迫下植物受損的參數(shù)[20]?？寡趸赶到y(tǒng)，如POD、SOD和CAT酶，通過將ROS保持在閾值水平來保護(hù)受脅迫的植物，這些酶的活性表明植物在非生物脅迫下的抗脅迫能力[21-22]。本研究中，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下膜損傷程度較低，表現(xiàn)為電解質(zhì)滲漏、ROS和MDA積累減少，表明活性氧清除系統(tǒng)的增強(qiáng)能力與BoWRKY10過表達(dá)植株的抗旱性增加密切相關(guān)，即BoWRKY10通過激活ROS清除系統(tǒng)提升煙草抗旱能力。

在干旱脅迫下，一些脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)。例如,GmWRKY16的過表達(dá)使脅迫相關(guān)標(biāo)記基因RD29A、RD22、KIN1和LEA14的表達(dá)顯著上調(diào)[23]。WRKY17s在其他植物中的負(fù)調(diào)控也有報(bào)道。在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥CmWRKY17中AtRD29A和ATDREB2的表達(dá)水平顯著下調(diào)[24]。此外，HaWRKY76的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)RAB18、RD29A和RD29B的表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性[25]。本研究表明，在干旱脅迫下，NtSOD、NtAPX、NtCAT、NtGST、NtSPSAt和NtNCED1等6個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。推測(cè)BoWRKY10可能通過直接或間接調(diào)控干旱脅迫相關(guān)基因來調(diào)控干旱脅迫。在今后研究中，對(duì)BoWRKY10蛋白與DNA結(jié)合位點(diǎn)及其BoWRKY10蛋白在其他環(huán)境脅迫中功能等方面進(jìn)行研究，探索其在基因調(diào)控中作用機(jī)理及其生理功能。

4 結(jié) 論

過表達(dá)羽衣甘藍(lán)BoWRKY10基因煙草顯著提高煙草在干旱脅迫下成活率、萌發(fā)率及抗氧化酶活性，增加可溶性糖含量和減少M(fèi)DA含量；NtSOD、NtAPX、NtCAT、NtGST、NtSPSAt和NtNCED1等6個(gè)ROS相關(guān)的脅迫響應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)。本研究表明BoWRKY10基因與干旱脅迫相關(guān)。這對(duì)培育羽衣甘藍(lán)新品種、探索基因調(diào)控機(jī)理等具有理論與實(shí)踐意義。