蘇培森，隋超，顏君，王晨，韓磊，王舒涵，劉曉倩，郭尚敬

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 聊城 252000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

小麥(Triticum aestivumL.)在我國已經(jīng)有五千多年的栽培歷史，種植區(qū)域廣泛，是目前我國僅次于水稻和玉米的第三大重要糧食作物，其制品是人類膳食的主要來源[1]。隨著人們生活水平的提高及對健康飲食的重視，對營養(yǎng)價值高、具有保健功能作物的需求日益增加[2－4]。小麥籽粒中胚乳、麩皮和胚芽分別占粒重的16.0%、81.2%、2.8%[5]。研究表明，增加全谷物的攝入可以有效預(yù)防心血管疾病、Ⅱ型糖尿病及癌癥等[6，7]。因此，培育特色功能性小麥品種對于改善人類膳食營養(yǎng)具有重要價值。

花青素(anthocyanins)屬于類黃酮次生代謝產(chǎn)物，是存在于高等植物體內(nèi)的一種常見水溶性色素。目前已知的花青素有600多種，植物中比較常見的主要有6類，分別為飛燕草素、芍藥素、矮牽牛色素、矢車菊素、錦葵色素和天竺葵素[8，9]。花青素具有著色、抵御紫外線傷害、抗低溫等生物學(xué)功能[10]?；ㄇ嗨厥侵参锘?、葉片、果實、種子等組織中紅、藍(lán)、紫等顏色的主要顯色物，從而使植物呈現(xiàn)出不同的顏色，具有一定的觀賞價值[11－15]?；ㄇ嗨乜杀Ｗo(hù)光系統(tǒng)Ⅱ免受到達(dá)葉綠體的多余光子的影響，有助于降低己糖積累從而起到糖緩沖作用，并對光合作用的反饋調(diào)節(jié)具有積極影響[16]?；ㄇ嗨赜兄谇宄{迫下植物體內(nèi)積累的活性氧，其含量與活性氧積累呈負(fù)相關(guān)，即花青素含量減少會降低植物的活性氧清除能力，導(dǎo)致組織中活性氧積累增多，使植物遭受更重的氧化損傷[17]；干旱和極端溫度變化會造成植物體內(nèi)花青素沉著，且干旱時間延長會增加色素沉著[18]。此外，花青素可以清除細(xì)胞中的自由基[19]，在預(yù)防肥胖、心血管健康、抗炎、抗癌等方面發(fā)揮著重要作用[20－22]，如能抑制脂蛋白氧化和血小板聚集[23]，對抑制老年人動脈粥樣硬化有一定的作用[24]；對改善與年齡有關(guān)的神經(jīng)退化和認(rèn)知下降等有一些有益作用，幫助老年人改善記憶力[25]；可在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[26－28]?；ㄇ嗨剡€能在一定程度上抑制視網(wǎng)膜的光化學(xué)損傷、放松睫狀平滑肌，起到保護(hù)視力的作用[29，30]。

不同類型的花青素主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮3－羥化酶(F3H)、黃酮3′－羥化酶(F3′H)、類黃酮3′，5′－羥化酶(F3′5′H)、二氫黃酮醇－4－還原酶(DFR)及無色花青素雙加氧酶/花青素合成酶(LDOX/ANS)等一系列酶催化合成，在經(jīng)過一個或多個位點的甲基化、?；蛱腔刃揎椇螅罱K形成穩(wěn)定的花青苷[31，32]，并由谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S－transferases，GST)或其他方式轉(zhuǎn)移至液泡中，形成各種不同的顏色[33]。目前編碼這些酶的很多基因已經(jīng)在模式植物擬南芥中確定，包括CHS(tt4)、CHI(tt5)、F3H(tt6)、F3′H(tt7)、DFR(tt3)、LDOX/ANS(tt18，tt11，tt17，tds4)、GSTF12(tt14，tt19)與MATE(tt12)[34]。研究表明，擬南芥中AtDFR基因可以通過誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜中花色苷的積累，有效地調(diào)控鹽分和干旱脅迫耐受性[35]；擬南芥UFGT基因突變會導(dǎo)致不能合成色素，并且在突變體中過表達(dá)TaUFGT－4能使花青素合成恢復(fù)[36]；將藤茶的AgCHS1基因在煙草中過表達(dá)，可以提高煙草花瓣中的花青素含量[37]；在煙草中過表達(dá)HbF3′H1基因會導(dǎo)致其花瓣大量積累花青素，與非轉(zhuǎn)基因煙草相比顏色顯著加深[38]。

目前對花青素的研究已有很多，但關(guān)于不同小麥品種間花青素含量及相關(guān)基因表達(dá)的差異還有待探究。因此，本試驗通過比較不同小麥栽培品種幼苗期花青素含量的差異，并利用qRT－PCR對花青素代謝相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，以篩選富含花青素的小麥品種及影響花青素合成的關(guān)鍵基因，為后續(xù)培育功能性小麥提供種質(zhì)資源和基因儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年9月至2022年3月在聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院進(jìn)行。供試58個小麥栽培品種為泡子麥、揚麥、蘇麥3號、小白麥、浙徐福75－3、介吉麥、Arz、紫優(yōu)6號、周黑麥1號、山農(nóng)紫麥1號、紫優(yōu)5號、土麥、絲粉麥、淮麥33、揚麥158、老芒麥、融安小麥、九太石、和尚麥、遲熟小麥、火燒麥、淮麥、洋拉子、銅柱頭、紅麥、宜都小麥、富陽小麥、田晚、魯麥15、煙5158、莞7815－5－2－1、東莞小麥、有芒紅殼、黃塘麥、白慈麥、崇洋小麥、農(nóng)林90、豬狼麥、白芒大籽、平頭麥、豫農(nóng)211、鄭麥6號、生選6號、濟(jì)麥44、宛麥20、紅殼繭子頭、有芒紅殼、白麥、中青、Cp07－14、軟稈洋麥、封麥6號、KN199、05Z4－020、和陽春、濟(jì)麥22、海鹽種、泰農(nóng)2413。挑選籽粒飽滿的種子，種植于營養(yǎng)土中培養(yǎng)3周，快速剪下小麥幼苗地上部分，迅速置于液氮中保存，用于花青素含量測定及RNA提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 花青素含量測定 參照Serrano等[39]的方法進(jìn)行，具體步驟如下:稱取50 mg小麥葉片置于1.5 mL離心管中，在液氮中研成粉末；加入700μL酸性甲醇(甲醇與HCl體積比為99∶1)，于4℃過夜提?。蝗缓笥?℃、12 000 r/min離心1 min，取600 μL上清液于新的離心管中，加入1 mL三氯甲烷，再加400 μL蒸餾水，于4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，利用分光光度儀(U－3000，HITACHI)分別在530、657 nm處測OD值。設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)，每組重復(fù)測3次。計算公式:W＝(OD530－0.25OD657)/m[39]，其中，W為花青素相對含量，OD530、OD657分別為530、657 nm處的光密度值，m為樣品質(zhì)量(g)。

利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用Graphpad prism 9軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD顯著性檢驗(P＜0.05)。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit)提取總RNA，然后用諾唯贊HiScript?ⅡQ RT Super-Mix for qPCR(＋gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。去除基因組DNA體系(16 μL):4×gDNA wiper Mix 4 μL，100～300 ng/μL模板RNA 3 μL，加RNase－free ddH2O至16 μL；用移液器輕輕混勻，置于42℃2 min。隨后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL(包括第一步反應(yīng)液16 μL，5×HiScriptⅡqRT SuperMix 4 μL)，用移液器輕輕混勻，然后50℃15 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再85℃5 s使反應(yīng)酶失活。

1.2.3 花青素合成相關(guān)基因的qRT－PCR檢測根據(jù)花青素合成的代謝通路，選取參與花青素合成的相關(guān)基因TaMYB－7D1、TaMYC－2A1、TaCHI－5D、TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT、TaCHS、TaF3′H、TaF3′5′H和TaANS，以小麥18S rRNA為內(nèi)參進(jìn)行qRT－PCR分析。引物(表1)使用Primer Premier 5設(shè)計，由北京擎科生物科技有限公司合成。熒光定量PCR擴(kuò)增使用諾唯贊熒光定量試劑盒(HiScriptⅢRT superMix)，反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA模板2.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×TB Green PremixTaqⅡ(TliRNaseHPlus)10 μL，ddH2O 7.2 μL。Real Time PCR反應(yīng)程序為:95℃30 s；95℃10 s，55℃32 s，72℃1 min，40個循環(huán)。

表1 花青素合成相關(guān)基因的qRT－PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 不同小麥栽培品種花青素含量多樣性分析

58個小麥栽培品種的花青素含量見表2，其中，浙徐福75－3的花青素含量最低，紅麥的花青素含量最高，是浙徐福75－3的6倍多；紫優(yōu)6號、Arz、生選6號、宛麥20、紫優(yōu)5號的花青素含量也較高；而泡子麥、蘇麥3號、淮麥、融安小麥、九太石、豬狼麥、泰農(nóng)2413、揚麥、小白麥、田晚的花青素含量較低。經(jīng)統(tǒng)計分析，有39個品種的花青素含量顯著高于蘇麥3號(P＜0.05)，有18個品種的花青素含量與蘇麥3號差異不顯著。

表2 不同小麥品種的花青素含量

2.2 花青素合成相關(guān)基因差異表達(dá)分析

為了進(jìn)一步闡釋不同小麥品種花青素合成的差異機(jī)制，從58個小麥品種中選擇含不同水平花青素的10個品種進(jìn)行花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析，包括紫優(yōu)6號、Arz、生選6號、紫優(yōu)5號、濟(jì)麥44、農(nóng)林90、封麥6號、小白麥、蘇麥3號和浙徐福75－3。

(1)調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子TaMYB－7D1、TaMYC－2A1的表達(dá)量在不同小麥品種間差異明顯，均在生選6號中高表達(dá)，在蘇麥3號中不表達(dá)。另外，TaMYB－7D1在花青素含量較高的Arz、花青素含量低的浙徐福75－3、花青素含量中等的濟(jì)麥44中表達(dá)量也較高，TaMYC－2A1在濟(jì)麥44中的表達(dá)量也較高，但兩者在其他品種中的表達(dá)量均顯著降低(圖1)。

圖1 調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子基因TaMYB－7D1、TaMYC－2A1在不同小麥品種中的表達(dá)情況

(2)花青素合成路徑上游相關(guān)基因TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT在不同小麥品種中的表達(dá)量也存在明顯差異，均在生選6號中表達(dá)量最高，在蘇麥3號中表達(dá)量最低(圖2)。其中，TaPAL－6D1－T2的表達(dá)量表現(xiàn)為生選6號＞農(nóng)林90＞浙徐福75－3＞濟(jì)麥44＞小白麥＞Arz＞紫優(yōu)5號＞紫優(yōu)6號＞封麥6號＞蘇麥3號，在紫優(yōu)6號、蘇麥3號和封麥6號中幾乎不表達(dá)，在浙徐福75－3、濟(jì)麥44、小白麥、Arz、紫優(yōu)5號中表達(dá)水平相對較低。TaDFR－3B－T1的表達(dá)量表現(xiàn)為生選6號＞浙徐福75－3＞農(nóng)林90＞Arz＞小白麥＞紫優(yōu)6號＞紫優(yōu)5號＞濟(jì)麥44＞封麥6號＞蘇麥3號，在紫優(yōu)6號、紫優(yōu)5號、濟(jì)麥44、封麥6號、蘇麥3號中幾乎不表達(dá)，在浙徐福75－3、農(nóng)林90、Arz中表達(dá)水平相對較低。TaUFGT的表達(dá)量表現(xiàn)為生選6號＞農(nóng)林90＞濟(jì)麥44＞紫優(yōu)6號＞紫優(yōu)5號＞Arz＞浙徐福75－3＞小白麥＞封麥6號＞蘇麥3號，在蘇麥3號中幾乎不表達(dá)，在紫優(yōu)5號、Arz、浙徐福75－3、小白麥、封麥6中表達(dá)水平相對較低。

圖2 花青素合成相關(guān)基因TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT的相對表達(dá)量

(3)花青素合成路徑的關(guān)鍵酶基因TaCHI－5D、TaCHS、TaF3′H、TaF3′5′H、TaANS的表達(dá)量也均以生選6號中最高，蘇麥3號或封麥6號中最低(圖3)。其中，TaCHI－5D在其他品種中的表達(dá)量較低，在小白麥、紫優(yōu)5號、封麥6號、蘇麥3號中幾乎不表達(dá)；TaCHS在紫優(yōu)6號中的表達(dá)水平也較高，僅略低于生選6號，在小白麥和蘇麥3號中幾乎不表達(dá)，在其他品種中的表達(dá)水平較低；TaF3′H在濟(jì)麥44、農(nóng)林90中的表達(dá)量也較高，在小白麥、紫優(yōu)6號、封麥6號中幾乎不表達(dá)，在其他品種中表達(dá)水平較低；TaF3′5′H在農(nóng)林90、濟(jì)麥44中表達(dá)水平也較高，在封麥6號、小白麥、蘇麥3號中幾乎不表達(dá)，在其他品種中表達(dá)水平相對較低；TaANS在浙徐福75－3、Arz、紫優(yōu)5號、濟(jì)麥44、農(nóng)林90中的表達(dá)量相對較高，在小白麥、蘇麥3號、封麥6號中幾乎不表達(dá)。

圖3 花青素合成路徑相關(guān)基因的表達(dá)量分析

綜合可見，上述基因均在花青素含量較高的生選6號中高表達(dá)，且表達(dá)量明顯高于其他品種；均在花青素含量較低的蘇麥3號中表達(dá)量很低或不表達(dá)，且除TaF3′H和TaANS表達(dá)量略高于封麥6號外，均明顯低于其他品種。其余品種中，紫優(yōu)6號的高表達(dá)基因是TaCHS；Arz、浙徐福75－3中TaMYB－7D1表達(dá)水平相對較高；紫優(yōu)5號中TaCHS、TaF3′5′H、TaF3′H、TaANS表達(dá)量較高；花青素含量中等的品種濟(jì)麥44中TaMYC－2A1表達(dá)水平相對較高；TaF3′5′H、TaF3′H、TaUFGT的表達(dá)水平在花青素含量中等的農(nóng)林90中相對較高。

3 討論與結(jié)論

花青素不僅是類黃酮化合物中的一種，也是對植物著色和果實顏色形成很重要的一種色素，植物各組織器官的著色情況與花青素等類黃酮物質(zhì)的生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)密不可分。目前，對植物類黃酮合成途徑的研究已相當(dāng)清楚。根據(jù)花青素生物合成途徑，可將調(diào)控花青素合成的基因分為上游結(jié)構(gòu)基因、早期結(jié)構(gòu)基因、后期結(jié)構(gòu)基因和修飾基因。上游結(jié)構(gòu)基因包括苯丙氨酸氨酰化酶基因(PAL)和4－香豆酸－CoA連接酶基因(4CL)；早期結(jié)構(gòu)基因包括CHS、CHI、F3H、F3′H和F3′5′H；后期結(jié)構(gòu)基因包括DFR和ANS；修飾基因包括葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GT)、甲基化轉(zhuǎn)移酶基因(MT)和?；D(zhuǎn)移酶基因(AT)[40－42]。但關(guān)于小麥花青素合成機(jī)制以及調(diào)控花青素合成相關(guān)基因功能驗證的研究還相對較少。

本研究對58個小麥栽培品種的測定分析表明，不同品種間花青素含量存在差異，紅麥、紫優(yōu)6號、Arz、生選6號、宛麥20、紫優(yōu)5號中的花青素含量較高，而浙徐福75－3、泡子麥、蘇麥3號、淮麥、融安小麥的含量較低。選用不同花青素含量等級的10個品種進(jìn)一步進(jìn)行花青素合成路徑相關(guān)基因(TaMYB－7D1、TaMYC－2A1、TaCHI－5D、TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT、TaCHS、TaF3′H、TaF3′5′H和TaANS)的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)各基因在不同小麥品種中的表達(dá)量差異明顯，均在花青素含量較高的生選6號中高表達(dá)，在花青素含量較低的蘇麥3號中表達(dá)量很低或不表達(dá)。此外，TaMYB－7D1和TaMYC－2A1表達(dá)水平在花青素含量中等的濟(jì)麥44中也較高，TaF3′5′H、TaF3′H和TaUFGT基因在中等花青素含量品種農(nóng)林90和濟(jì)麥44中表達(dá)水平也較高；紫優(yōu)6號的高表達(dá)基因是TaCHS；Arz、浙徐福75－3中TaMYB－7D1表達(dá)水平相對較高；紫優(yōu)5號中TaCHS、TaF3′5′H、TaF3′H、TaANS表達(dá)量較高，其余基因也均有一定表達(dá)。推測TaMYB－7D1、TaMYC－2A1、TaF3′5′H、TaF3′H、TaUFGT、TaCHS和TaANS可能在小麥花青素合成中扮演著更為重要的角色，其在不同品種中表達(dá)模式的差異可能是引起花青素含量存在明顯差異的重要原因，這可為今后進(jìn)一步探索調(diào)控小麥花青素含量的分子機(jī)制提供重要的基因資源和種質(zhì)儲備。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因?qū)偕嫌谓Y(jié)構(gòu)基因，在植物花青素合成過程中扮演著重要的角色。前期有報道指出，在擬南芥中，細(xì)胞分裂素(Cytokinin)能夠通過誘導(dǎo)PAL1、CHI、CHS和DFR等基因的表達(dá)從而促進(jìn)花青苷的積累[43]。本研究發(fā)現(xiàn)TaPAL－6D1－T2在10個小麥品種中均表達(dá)，尤其在花青素含量高的小麥品種中表達(dá)水平較高。

CHS是黃酮類化合物合成途徑的入口，可將1分子的香豆酰－CoA和3分子的丙二酰－CoA合成黃色的查耳酮，然后CHI再將查耳酮異構(gòu)化形成柚皮素，柚皮素在F3H的作用下形成二氫山奈酚，然后分別在F3′H和F3′5′H的催化下形成二氫槲皮素和二氫楊梅素[44，45]。F3′H和F3′5′H都屬于P450細(xì)胞色素家族，分別是負(fù)責(zé)為飛燕草素和矢車菊素形成提供底物的關(guān)鍵酶[46]。本研究結(jié)果顯示，TaCHS基因在生選6號中的表達(dá)量最高，在紫優(yōu)6號中次之，均明顯高于在其他品種中的表達(dá)；TaCHI－5D基因在生選6號中特異性高表達(dá)，在其他品種中表達(dá)量較低或不表達(dá)；F3′H和F3′5′H基因在生選6號、農(nóng)林90和濟(jì)麥44中的表達(dá)量相對較高，尤以生選6號中的表達(dá)量最高。表明這4個基因在不同品種小麥花青素合成過程中發(fā)揮著不同的作用，其具體的功能及調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

DFR和ANS是花青素合成路徑中主要的后期結(jié)構(gòu)基因。其中，DFR是花青素合成途徑后期的第一個關(guān)鍵酶，是一種還原酶，可催化二氫山奈酚、二氫槲皮素、二氫楊梅素分別形成無色不穩(wěn)定的原天竺葵素苷元、原矢車菊素苷元和原飛燕草素苷元，然后ANS、GT、AT及MT再將無色的花青素苷元合成有色且穩(wěn)定的花青素苷，從而使植物呈現(xiàn)不同的顏色[47，48]。此外，DFR還可借助NADPH的作用將二氫黃酮醇催化成原花青素苷元，為下一步有色花青素苷的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)[48]，而且其對底物的特異性決定了一種植物積累哪種花青素[49]。ANS是植物花青素生物合成末期的關(guān)鍵酶，主要催化無色花色素向有色花色素轉(zhuǎn)變[50]。在煙草中過量表達(dá)McANS能夠使煙草花瓣花青素積累增加，花色加深[51]。本研究結(jié)果顯示TaDFR－3B－T1在不同花青素含量小麥品種中均表達(dá)，但表達(dá)量不同，在生選6號中的表達(dá)量顯著高于其他品種；TaANS在生選6號、Arz、紫優(yōu)5號、浙徐福75－3、濟(jì)麥44和農(nóng)林90等花青素含量較高的品種中表達(dá)量明顯高于其他品種。

此外，前人研究表明貴紫麥1號中GzMYB－7D1和GzMYC－2A1參與調(diào)控其花青素合成[52]。本研究也發(fā)現(xiàn)TaMYB－7D1和TaMYC－2A1在不同小麥品種中表達(dá)水平差異明顯，尤其在花青素含量較高的生選6號、浙徐福75－3和濟(jì)麥44中表達(dá)量較高。

綜上所述，本研究篩選到一些花青素含量較高的小麥栽培品種，并初步探索了調(diào)控花青素合成的相關(guān)基因在不同花青素含量小麥品種中的表達(dá)情況。這不僅可為功能性小麥品種選育提供優(yōu)異的種質(zhì)資源，也可為小麥花青素合成機(jī)制的深入探究提供理論基礎(chǔ)和基因儲備。