唐有男，吳 濤，范 鵬，陳積豪，吳紅彥

（廣東省深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 羅湖 518000）

小兒遺尿癥（Infantile Enuresis，IE）是指5歲以上兒童，每周2次以上，不能從睡眠中醒來(lái)無(wú)意識(shí)地排尿，連續(xù)3個(gè)月以上[1-2]。據(jù)權(quán)威統(tǒng)計(jì)[3]在全球5歲兒童中大約有16%的兒童患有該病，在11～12歲兒童中大約有5%的兒童患有該病。中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)在2020年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)IE患病率大約為4.8%，而由于年齡、性別、農(nóng)村、城市等的差異，許多患兒同時(shí)還存在一定的心理問(wèn)題[4]。長(zhǎng)期得不到有效的治療就會(huì)致其憂(yōu)郁、性格內(nèi)向，而焦慮、注意力不集中，學(xué)習(xí)和生活受到嚴(yán)重影響[5]。西醫(yī)對(duì)該病的治療主要以基礎(chǔ)、報(bào)警器、藥物等療法為主[6]，但臨床療效欠佳，且復(fù)發(fā)率高，更有甚者報(bào)道有副作用[7-8]。中藥以多成分、多靶點(diǎn)、多通路的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[9]。有研究表明麻黃治療小兒遺尿臨床療效顯著[10]。

麻黃，性味辛，微苦，溫，歸肺和膀胱經(jīng)，最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，記載其功效為:“主中風(fēng)，傷寒頭痛，溫瘧，發(fā)表汗，去邪熱氣，止咳逆上氣，除寒熱，破積聚”[11]。具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫等功效[12]?，F(xiàn)代藥理研究麻黃堿在治療小兒遺尿療效顯著，可能增強(qiáng)了膀胱三角肌及膀胱括約肌的張力，減少膀胱儲(chǔ)藏的尿量[13]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)對(duì)中藥麻黃多成分、多靶點(diǎn)與小兒遺尿生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行探究[14]，進(jìn)一步探究麻黃防治 小兒遺尿的潛在機(jī)制并揭示其科學(xué)內(nèi)涵，為藥理研究和臨床運(yùn)用提供理論支撐。

1 方法

1.1 活性成分篩選

中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）[15]（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），將口服生物利用度OB≥30%，類(lèi)似度（DL）≥0.18設(shè)定為篩選條件[16]進(jìn)行藥物化合物的篩選。

1.2 活性成分靶點(diǎn)的獲取

運(yùn)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt）[17]（http：//www.uniprot.org/），將“human”設(shè)置為限定物種，利用Perl軟件校正靶點(diǎn)名稱(chēng)。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因獲取

以“小兒遺尿”為關(guān)鍵詞，在OMIM（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），GeneCards[18]（https://www.genecards.org/）獲取小兒遺尿的基因靶點(diǎn)，運(yùn)用R軟件前，安裝Venny包，將麻黃主要有效活性成分、靶點(diǎn)和小兒遺尿基因靶點(diǎn)，獲得該藥與IE的交集靶點(diǎn)，即為藥物治療IE的核心靶點(diǎn)。

1.4 藥物-靶點(diǎn)-小兒遺尿網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將麻黃治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳到Cytoscape[19]（http：//www.cytoscape.org），構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-小兒遺尿”P(pán)PI圖。網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建并呈現(xiàn)藥物-靶點(diǎn)-小兒遺尿之間的聯(lián)系，進(jìn)一步探究麻黃治療小兒遺尿的作用機(jī)制。通過(guò)中心度、節(jié)點(diǎn)度值進(jìn)一步挖掘核心麻黃治療小兒遺尿的節(jié)點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建PPI（Protein-ProteinInteraction）

將治療的核心靶點(diǎn)輸入STRING[20]數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）中，將篩選物種設(shè)定為“Homo Sapiens”，將Mediumconfidence設(shè)定大于0.4，獲取蛋白靶點(diǎn)信息，構(gòu)建PPI圖，以txt文件保存。運(yùn)用Cytoscape中的Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，包括度值、介度值、中心度值分析，獲取核心靶點(diǎn)。

1.6 GO注釋及KEGG通路分析

運(yùn)用R語(yǔ)言，將篩選條件P＜0.05，進(jìn)行GO、KEGG富集分析，同時(shí)對(duì)結(jié)果可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

運(yùn)用TCMSP查找藥物主要有效活性成分，設(shè)定OB≥30%和DL≥0.18 為主要有效活性成分的篩選條件，獲得潛在有效活性成分15個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 麻黃活性成分表

2.2 麻黃治療小兒遺尿的潛在作用靶點(diǎn)

獲得藥物主要有效成分為15個(gè)。在GeneCards、OMIM庫(kù)中共搜索小兒遺尿相關(guān)靶點(diǎn)，運(yùn)用R語(yǔ)言安裝“VennDiagram”包，將藥物核心靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得麻黃有效活性成分治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點(diǎn)，得到韋恩圖（圖1）。獲得靶點(diǎn)27個(gè)，揭示了麻黃可能是調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療小兒遺尿的作用。

圖1 麻黃有效成分作用靶點(diǎn)及小兒遺尿靶點(diǎn)交集

2.3 藥物-靶點(diǎn)-小兒遺尿網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)Cytoscape對(duì)藥物治療小兒遺尿的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)繪制和統(tǒng)計(jì)。揭示了藥物主要活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)的關(guān)系（圖2）。中心度、度值揭示了節(jié)點(diǎn)在PPI圖中核心度的高低，度值越高，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在圖中的作用越顯著。研究按Degree值和BC值大小排序篩選核心成分和靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，山柰酚、槲皮素、木犀草素、β谷甾醇、豆甾醇、芫花素等麻黃有效成分是網(wǎng)絡(luò)圖的核心節(jié)點(diǎn)，這些核心節(jié)點(diǎn)是麻黃治療小兒遺尿的主要靶點(diǎn)，見(jiàn)表2。

圖2 麻黃治療小兒遺尿網(wǎng)絡(luò)圖

表2 麻黃治療小兒遺尿拓?fù)鋵W(xué)特征

2.4 麻黃治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點(diǎn)

使用在線平臺(tái)STRING，導(dǎo)入麻黃治療小兒遺尿的靶點(diǎn)，設(shè)定篩選條件P＞0.9，將游離蛋白隱藏，獲得PPI圖（圖3）。該圖節(jié)點(diǎn)共27個(gè)，邊171條，平均值12.7。圖中的“節(jié)點(diǎn)”代表麻黃靶點(diǎn)，“邊”表示核心靶點(diǎn)的相互作用。邊數(shù)越多表示該節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越顯著。運(yùn)用R語(yǔ)言繪制信息條形圖（圖4）。結(jié)果ESR1、IL6、EGFR、AR、CASP3、CCND1等蛋白的度值較高，說(shuō)明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用顯著，是和其他蛋白互通的紐帶。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息條形圖

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析

進(jìn)一步闡明靶點(diǎn)的可能性對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG分析。GO揭示麻黃治療小兒遺尿的關(guān)鍵靶點(diǎn)前5個(gè)生物學(xué)功能主要為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（8個(gè)靶點(diǎn)），核受體活性（5個(gè)靶點(diǎn)），配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性（5個(gè)靶點(diǎn)），RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（6個(gè)靶點(diǎn)），ATP酶結(jié)合（5個(gè)靶點(diǎn)）等,表明麻黃主要有效活性成分可以通過(guò)調(diào)控多種途徑而發(fā)揮治療小兒遺尿的作用（圖5）。運(yùn)用KEGG富集分析，獲取31條信號(hào)通路圖，將P值＜0.01為篩選條件，得到17條通路。設(shè)置P值和相關(guān)基因的數(shù)量為篩選條件，獲取前4條通路進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。分析發(fā)現(xiàn)，基因顯著富集在AGE/RAGE（6個(gè)位點(diǎn)基因）、HIF-1（5個(gè)位點(diǎn)基因）、Estrogen（8個(gè)位點(diǎn)基因）、Thyroid（5個(gè)位點(diǎn)基因）等信號(hào)通路上。

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)注釋信息圖

圖6 KEGG富集分析圖

3 討論

本次研究出麻黃主要活性成分15個(gè)，獲得27個(gè)治療靶點(diǎn)，繪制成“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，麻黃主要有效活性成分為山柰酚、槲皮素、木犀草素、β谷甾醇、豆甾醇、芫花素等藥物活性成分。獲得ESR1、IL6、EGFR、AR、CASP3、CCND1蛋白，GO富集分析結(jié)果證實(shí)，麻黃治療小兒遺尿的基因功能主要體現(xiàn)在RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性，核受體活性，ATP酶結(jié)合等過(guò)程，KEGG 富集分析，共獲得31條通路，其中主要為4條通路，分別為AGE/RAGE、HIF-1、Estrogen、Thyroid等，因此，推測(cè)麻黃中的主要活性成分是通過(guò)上述通路基因來(lái)達(dá)到治療小兒遺尿的目的的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為探究麻黃治療小兒遺尿的一種新方法，同時(shí)也遵循了中醫(yī)的整體觀。從整體觀的角度去探究麻黃與小兒遺尿之間的關(guān)聯(lián)性，揭示麻黃是一種多成分、多途徑、多通路的協(xié)同作用，通過(guò)調(diào)控不同的靶標(biāo)、不同的通路，發(fā)揮治療作用。借助該方法，探討了麻黃治療小兒遺尿的作用機(jī)制，同時(shí)也揭示了麻黃治療小兒遺尿多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為麻黃治療小兒遺尿的藥物研究提供了依據(jù)，為實(shí)驗(yàn)和臨床的研究提供了新的思路。