鄭曉宇，魏兵，廖世峨，張超，劉亞軍，朱麗

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院新生兒科，遼寧 沈陽 110016)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以慢性氣道炎癥為特征的有一定潛在危險(xiǎn)的異質(zhì)性疾病，具有可變性呼氣氣流受限[1-2]。疾病花銷、入院率及死亡率正逐年攀升。兒童哮喘發(fā)病與環(huán)境、基因及環(huán)境與基因間的相互作用有關(guān)[3]。

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)的基因密集區(qū)位于染色體6p21.23，研究表明該處基因可能與哮喘相關(guān)表型有關(guān)[4],MHC區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)主要位于人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)I類和II類分子上[5]，有助于免疫系統(tǒng)發(fā)揮對(duì)抗外來入侵的作用。有研究表明[5]123-134HLA-DQ等位基因與哮喘表型間存在關(guān)系，DQ異構(gòu)蛋白在哮喘發(fā)病中有重要作用。HLA-DQ與其他基因在兒童肺炎支原體感染相關(guān)哮喘中也存在交互作用[6]。HLA-DQB1的多個(gè)SNP位點(diǎn)也被證實(shí)可能與巴基斯坦旁遮普地區(qū)人群哮喘發(fā)作有關(guān)[7]。

HLA-DQB1 rs1063355位點(diǎn)曾被報(bào)道可能與亞洲裔印度人哮喘易感性相關(guān)[8]，全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)提示HLA-DQB1基因位點(diǎn)多態(tài)性可能與哮喘相關(guān)，尚無兩個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性與東北地區(qū)漢族兒童哮喘易感性間研究。因此，本研究擬通過分析中國東北地區(qū)哮喘患兒HLA-DQB1 rs1063355、rs6906021位點(diǎn)SNPs及臨床資料，研究其與兒童哮喘發(fā)病及吸入糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroids,ICS)療效間關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

將2016年10月至2020年10月在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院診斷哮喘的來自東北地區(qū)6～12歲106例漢族兒童納入病例組，符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除其中患有先天免疫缺陷病和胃食管反流等會(huì)引起兒童反復(fù)喘息的其他種類疾?。磺胰虢M前未使用過任何抗哮喘治療藥物。其中男57 例，女49 例，平均年齡(8.2±2.0)歲。選取同期就診的100例來自東北地區(qū)漢族健康兒童作為對(duì)照組，對(duì)照組中男55例，女45例，平均年齡(8.9±2.2)歲，經(jīng)對(duì)比兩組在年齡、性別上均無明顯差異(t=-2.778，χ2=0.031，P>0.05)，具有可比性。倫理批準(zhǔn)號(hào)：Y(2020)054號(hào)，家屬知情同意。對(duì)所有病例組兒童根據(jù)哮喘嚴(yán)重分級(jí)方法及急性發(fā)作期臨床特征分組。病例組給予吸入用糖皮質(zhì)激素布地奈德混懸液霧化吸入、每次1 mg、每日2次，逐步減量，并于入組時(shí)及入組3個(gè)月分別行肺功能檢測(cè)及C-ACT/ACT量表評(píng)估。排除其中因?yàn)椴涣挤磻?yīng)(n=2)、失訪(n=11)、數(shù)據(jù)不完整(n=14)等因素的研究對(duì)象，共79例符合療效研究條件。

1.2 基因檢測(cè)

1.2.1 DNA提?。翰杉庵苎? mL，置于EDTA抗凝管，經(jīng)臺(tái)式離心機(jī)Mikro120進(jìn)行30 min離心處理后留取下層血細(xì)胞，試劑盒進(jìn)行DNA提取，采用HF8/HF16 核酸純化儀。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成：依次對(duì)DNA樣本進(jìn)行電泳、質(zhì)量檢查及濃度評(píng)估及稀釋。查找GeneBank上發(fā)表的關(guān)于人HLA-DQBI rs1063355、rs6906021基因部分序列，采用PREMERPLEX2設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物進(jìn)行引物合成及純化，設(shè)計(jì)引物見表1。反應(yīng)體系共20 μL，組成包含1 × 10X buffer(Takara.)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL 樣本DNA和1 μL多重PCR引物。在10 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，在37 ℃條件下溫浴1 h，然后在75 ℃條件下滅活15 min。經(jīng)過PCR及SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)后，向延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，在37 ℃條件下溫浴1 h，然后經(jīng)過75 ℃滅活15 min，取0.5 μL延伸產(chǎn)物，與0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.3 測(cè)序

ABI3730XL對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，用 GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA)分析原始數(shù)據(jù)。rs1063355位點(diǎn)熒光吸收峰圖如圖1所示，rs6906021位點(diǎn)熒光吸收峰圖，見圖2。

黑色箭頭所指即為等位基因位置，從上至下依次為T/T型、T/G型、G/G型

黑色箭頭所指即為等位基因位置，從上至下依次為T/T型、T/C型、C/C型

1.2.4 肺常規(guī)通氣功能測(cè)定及C-ACT/ACT評(píng)分

德國Jaeger公司Master Screen測(cè)試系統(tǒng)在入組時(shí)及入組3個(gè)月后分別檢測(cè)肺功能，共檢測(cè)3次；記錄患兒肺常規(guī)通氣FEF25、FEF50、FEF75絕對(duì)值、預(yù)計(jì)值及其比值，并計(jì)算相應(yīng)指標(biāo)改善率=[(治療后數(shù)值-入組時(shí)數(shù)值)/入組時(shí)數(shù)值]×100%；治療3個(gè)月時(shí)做C-ACT或ACT哮喘控制評(píng)分，總分≤19分為控制差，≥20分為控制好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 rs1063355、rs6906021位點(diǎn)基因型及等位基因分布：采用哈迪-溫伯格平衡定律檢驗(yàn)rs1063355、rs6906021 SNP位點(diǎn)基因型分布，兩個(gè)位點(diǎn)基因型頻率均符合遺傳平衡定律(P>0.05)，說明樣本群體代表性較好。

2.1.1 rs1063355、rs6906021位點(diǎn)病例組與對(duì)照組基因型分布

rs1063355位點(diǎn)野生型為T/T型，變異型為T/G、G/G，對(duì)比野生型與變異型在病例組與對(duì)照組中的分布情況，未發(fā)現(xiàn)存在明顯的組間差異(χ2=0.335，P>0.05)；分別將病例組和對(duì)照組的野生型T/T與雜合子變異型T/G基因型頻率、野生型T/T與純合子變異型G/G基因型頻率比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.000，χ2=1.580，P>0.05)，見表2。

rs6906021位點(diǎn)野生型T/T，變異型為T/C、C/C，對(duì)比野生型與變異型在哮喘組與對(duì)照組中的分布情況，發(fā)現(xiàn)病例組變異型頻率明顯高于對(duì)照組(χ2=5.293，P<0.05)。將病例組與對(duì)照組的野生型與兩種變異型基因型頻率對(duì)比，發(fā)現(xiàn)病例組變異型T/C與C/C基因型頻率均高于對(duì)照組(χ2=4.148，χ2=4.228，P<0.05)，見表2。

表2 病例組與對(duì)照組 rs1063355、rs6906021SNPs 基因型分布[n(%)]

2.1.2 rs1063355、rs6906021位點(diǎn)病例組與對(duì)照組等位基因分布

rs1063355位點(diǎn)T、G等位基因在病例組與對(duì)照組間分布無明顯差異(χ2= 2.821，P>0.05)；而rs6906021位點(diǎn)病例組與對(duì)照組T、C等位基因頻率有差異，病例組C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組(χ2=4.611，P<0.05)，見表3。

表3 病例組與對(duì)照組 rs1063355、rs6906021SNPs 等位基因分布[n(%)]

2.2 rs1063355、rs6906021位點(diǎn)SNPs與兒童哮喘嚴(yán)重程度關(guān)系

rs1063355位點(diǎn)輕度組與中重度組間野生型T/T、變異型(T/G+G/G)頻率無明顯差異(P>0.05)，T/T與T/G及G/G基因型頻率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表4。rs6906021位點(diǎn)輕度組與中重度組野生型與變異型基因型頻率無明顯差異(P>0.05)。T/T與T/C、C/C基因型頻率對(duì)比，無明顯差異(P>0.05)，見表4。

表4 輕度組與中重度組 rs1063355、rs6906021 SNPs基因型分布[n(%)]

對(duì)比rs1063355位點(diǎn)輕度組與中重度組兩種不同等位基因在分布上無明顯差異(χ2=0.722，P>0.05)，對(duì)比rs6906021輕度組與中重度組兩種等位基因型頻率亦未發(fā)現(xiàn)明顯差異(χ2=0.647，P>0.05)，見表5。

表5 輕度組與中重度組 rs1063355、rs6906021SNPs等位基因分布[n(%)]

2.3 rs1063355、rs6906021位點(diǎn)基因型與氣道功能指標(biāo)變化間關(guān)系

分析對(duì)比氣道指標(biāo)的實(shí)測(cè)值/預(yù)測(cè)值比值，F(xiàn)EF25野生型及變異型組改善率分別為(20.83±3.46)%、(18.12±4.36)%，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.204，P>0.05)。野生型FEF50改善率為(16.09±5.48)%、變異型FEF50改善率為(30.35±9.46)%，野生型FEF75改善率為(25.38±11.26)%、變異型FEF75改善率為(36.83±17.40)%，變異型FEF50及FEF75改善率明顯高于野生型(t=-1.845、-0.847，P<0.05)，見圖3。

A：FEF25；B：FEF50；C：FEF75

FEF25、50、75野生型及變異型間改善率未見明顯差異(t=1.607、-1.323、-1.941，P>0.05)，其中FEF25野生型、變異型改善率分別為(18.44±5.39)%、(18.15±3.90)%；FEF50野生型、變異型改善率分別為(23.00±7.73)%、(27.96±11.02)%；FEF75野生型、變異型改善率分別為(29.01±9.24)%、(32.23±12.09)%，見圖4。

A：FEF25；B：FEF50；C：FEF75

2.4 rs1063355、rs6906021位點(diǎn)基因型及兒童哮喘控制情況

通過分析rs1063355位點(diǎn)野生型與變異型患兒哮喘控制情況，發(fā)現(xiàn)野生型哮喘控制情況優(yōu)于變異型，但差異不明顯(χ2=0.526，P=0.677)，見表6；比較rs6906021位點(diǎn)野生型與變異型哮喘控制情況，發(fā)現(xiàn)變異型哮喘控制情況優(yōu)于野生型，差異亦不明顯(χ2=0.130,P=0.757)，見表6。

表6 哮喘控制情況[n(%)]

3 討 論

HLA基因家族由定位于6號(hào)染色體短臂2區(qū) 1帶的人類主要相容性復(fù)合體基因簇編碼，總長度達(dá)3600 kb[10]。HLA基因家族編碼HLA復(fù)合體蛋白，參與抗原呈遞及免疫反應(yīng)，與哮喘、過敏性皮炎發(fā)病有關(guān)[11]。HLA基因以Ⅰ、Ⅲ、Ⅱ類的順序在染色體上排列，其中Ⅱ類為決定免疫功能的主要區(qū)域。主要參與人類機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)及相應(yīng)調(diào)節(jié)，直接間接引起包括哮喘在內(nèi)的多種免疫性疾病[12-13]。HLA-II類基因主要由 DR、DQ和 DP 3個(gè)亞型組成，其中DQ亞型組成之一為DQB1[11]325-339。

DQB1的基因片段覆蓋786 bp，參與261個(gè)氨基酸的編碼合成。Al-Timimi DJ等[14]人發(fā)現(xiàn)相對(duì)健康人活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)等位基因DQBI×06頻率更高，且越嚴(yán)重或活動(dòng)性越高患者體內(nèi)該等位基因頻率越高。此外，DQB1基因的變異還被發(fā)現(xiàn)可能會(huì)影響日本腦炎滅活疫苗誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)[15]，更加支持其在體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)中的作用。阿聯(lián)酋的研究[16]發(fā)現(xiàn)DQBI的多個(gè)等位基因、基因型及單倍型被證實(shí)與1型糖尿病有關(guān)，但卻未在歐、亞、非人群中確未發(fā)現(xiàn)，提示該基因與疾病關(guān)系在不同地區(qū)及民族中存在差異。

HLA-DQB1多態(tài)性與哮喘關(guān)系正成為研究熱點(diǎn)。1994年意大利Mapp等[17]對(duì)二異氰酸誘發(fā)的哮喘患者研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1基因多態(tài)性與氰酸酯誘發(fā)的哮喘相關(guān)，韓國研究[18]同樣發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1基因多態(tài)性與二異氰酸酯誘發(fā)的職業(yè)哮喘有關(guān)，Lara-marquez ML等[19]針對(duì)委內(nèi)瑞拉人群研究發(fā)現(xiàn)，DQB1多態(tài)性可能與哮喘易感性相關(guān)，Suarez-Pajes E等[20]通過研究證實(shí)HLA-DQB1 rs1049213位點(diǎn)變異與哮喘風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。本研究首次將HLA-DQBI rs6906021位點(diǎn)納入，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T和C兩種等位基因，與現(xiàn)有人類基因庫相同，野生型T/T，變異型為T/C、C/C。C等位基因組及攜帶C等位基因的變異型更易患哮喘，提示該位點(diǎn)可能為中國東北漢族兒童的哮喘易感位點(diǎn)，該位點(diǎn)多態(tài)性影響疾病臨床表型的機(jī)制尚待明確，猜測(cè)其多態(tài)性可影響與HLA相結(jié)合的抗原種類不同發(fā)揮作用，進(jìn)而使遞呈至T細(xì)胞效率不同[21]，或影響TH1 /TH2細(xì)胞免疫反應(yīng)平衡[22]，直接間接引起哮喘。rs1063355位點(diǎn)位于3’UTR區(qū)，有T、G兩種等位基因，G等位基因占比較高，構(gòu)成野生型T/T，變異型T/G、G/G，然而本研究結(jié)果提示rs1063355 位點(diǎn)并非中國東北漢族哮喘兒童易感基因位點(diǎn)，然而美國維克森林大學(xué)醫(yī)學(xué)院的測(cè)序結(jié)果[23]卻與之相反，分析原因可能與納入對(duì)象的種族及國家不同有關(guān)，更證明其多態(tài)性研究在哮喘中意義。

ICS作為支氣管哮喘緩解期常用藥[2]1023-1048，能夠緩解氣道內(nèi)炎癥及改善肺部氣道功能，實(shí)現(xiàn)哮喘有效控制，本研究未發(fā)現(xiàn)治療后不同基因型患者C-ACT/ACT評(píng)分存在顯著差異，但在肺功能指標(biāo)研究中卻發(fā)現(xiàn)rs1063355位點(diǎn)變異型FEF50及FEF75實(shí)測(cè)值占預(yù)計(jì)值改善率明顯高于野生型，作為衡量小氣道功能指標(biāo)的FEF50及FEF75，其實(shí)測(cè)值占預(yù)計(jì)值變化率出現(xiàn)基因型差異，提示該位點(diǎn)變異后的治療效果可能更好，這種變異可能導(dǎo)致了不同基因型間ICS的藥效差異，對(duì)臨床指導(dǎo)用藥方面存在一定價(jià)值。

現(xiàn)有研究集中于兒童哮喘疾病易感性，且種族、地域及表型異質(zhì)性相對(duì)受限，本研究一定程度填補(bǔ)了空白，對(duì)篩選東北漢族兒童哮喘易感基因及臨床有一定意義，但不足之處是，需要增加樣本量或增加臨床指標(biāo)維度進(jìn)行研究。