袁 濤， 邢 蕊

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所胃腸腫瘤生物學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)胃癌的發(fā)病率和死亡率均高居第三位[1]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因之一[2]，以往研究發(fā)現(xiàn)，即便是在腫瘤早期，腫瘤細(xì)胞也會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，因此，鑒定導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因是防治胃癌轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)患者生存期的關(guān)鍵[4-5]。

以往研究表明，胃黏膜屏障的破壞是胃癌發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素[6-7]。黏蛋白家族是一種高度糖基化修飾的高分子量蛋白家族，由上皮組織產(chǎn)生，具有組織潤(rùn)滑及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能，是胃黏膜保護(hù)屏障的主要組成成分[8]。近年來(lái)，黏蛋白作為腫瘤分子標(biāo)志物倍受重視。如MUC1在胃癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[9]；MUC16在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)室主要針對(duì)MUC17進(jìn)行了系統(tǒng)研究。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)MUC17在胃癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后呈正相關(guān)[11-12]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MUC17可以通過(guò)抑制NF-κB通路抵御炎癥因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，從而延長(zhǎng)患者生存期[11]。腫瘤細(xì)胞的惡性行為不僅與炎癥相關(guān)，更與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密不可分，因此，在本研究中我們著重闡述MUC17的表達(dá)與胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織標(biāo)本和胃癌細(xì)胞：本研究使用的103例胃癌組織來(lái)自于北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院手術(shù)樣本，所有患者在取材前均未接受任何放化療等治療，術(shù)后病理診斷均為原發(fā)胃癌。本研究獲得北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2018KT14)。本研究所用胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS為貼壁細(xì)胞，購(gòu)自ATCC(The Global Bioresource Center)，使用含1%青霉素-鏈霉素、質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑：FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(E2311，Promega，美國(guó))，兔抗人MUC17抗體(HPA031634，Sigma，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化：胃癌組織樣本經(jīng)中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋后制備白片，按如下步驟進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)：石蠟切片脫蠟至水，高壓抗原熱修復(fù)，3% H2O2室溫孵育10 min清除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性，質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉室溫孵育1 h封閉，滴加稀釋后的MUC17抗體4 ℃過(guò)夜孵育，PBS沖洗5 min×3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，流水返藍(lán)，封片。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)出針對(duì)MUC17進(jìn)行干擾的靶序列：ATACCAACCTCGACTCTTA[11]。根據(jù)靶序列，按照pSilencer質(zhì)粒說(shuō)明書(shū)人工合成一對(duì)互補(bǔ)并編碼siRNA的寡核苷酸鏈。將1 μl 2 μmol/L的正、反義寡核苷酸鏈混合，加熱至95 ℃并緩慢冷卻至室溫，形成雙鏈。用BamHI與HindIII雙酶切pSilencer載體質(zhì)粒，瓊脂糖電泳純化回收后在T4連接酶催化下與退火形成的雙鏈連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序?qū)χ亟M載體進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d，將AGS細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度為60%～80%時(shí)，依據(jù)Promega FuGENE HD試劑說(shuō)明書(shū)，將混勻后的轉(zhuǎn)染試劑-質(zhì)?；旌衔锛尤爰?xì)胞培養(yǎng)基中(轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒=3∶1)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)：消化AGS細(xì)胞于含質(zhì)量濃度為20 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基，將含2×105個(gè)細(xì)胞的100 μl細(xì)胞懸液加入上室中，下室中加入800 μl含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入PBS的孔中洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫室溫染色15 min。

1.2.4 TCGA數(shù)據(jù)分析：我們用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn)[13]分析TCGA胃癌樣本中MUC17和CDH1表達(dá)的相關(guān)性，使用Pearson相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MUC17的表達(dá)與胃癌患者轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MUC17的表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)為了確定MUC17對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，我們首先利用免疫組化實(shí)驗(yàn)在103例胃癌組織中檢測(cè)了MUC17的表達(dá)與胃癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。如表1所示，MUC17的表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。如圖1所示，相對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位癌，MUC17高表達(dá)于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位癌。

表1 MUC17的表達(dá)與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

圖1 用免疫組化在發(fā)生(A)/未發(fā)生(B)轉(zhuǎn)移的原位癌中檢測(cè)MUC17的表達(dá)(放大100倍)

2.2 MUC17抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移為了研究MUC17對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，我們進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。如圖2所示，在胃癌細(xì)胞AGS中干擾MUC17的表達(dá)后，AGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯增加。

注：A～B：在AGS細(xì)胞中用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾MUC17的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，A為CTRL,B為sh-MUC17,放大200倍；C：Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移AGS細(xì)胞數(shù)的直方圖。n=3。

2.3 MUC17的表達(dá)與CDH1的表達(dá)呈正相關(guān)CDH1基因編碼的E-鈣黏蛋白是鈣依賴(lài)性細(xì)胞黏附蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷移，其功能缺失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[14-15]。為了闡明MUC17抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們利用TCGA數(shù)據(jù)分析MUC17與CDH1表達(dá)的相關(guān)性。如圖3所示，MUC17的表達(dá)與CDH1的表達(dá)呈正相關(guān)(R=0.46，P<0.001)。

圖3 利用TCGA數(shù)據(jù)分析MUC17與CDH1表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，MUC17具有抑制胃癌細(xì)胞增殖、抵御炎癥因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，以及抑制幽門(mén)螺桿菌毒力蛋白CagA轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞的功能[11-12]，本研究又發(fā)現(xiàn)該基因具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力。研究發(fā)現(xiàn)MUC17在胃癌組織中高表達(dá)，即便是在腫瘤早期也可以檢測(cè)到MUC17的高表達(dá)，且其表達(dá)與患者預(yù)后呈正相關(guān)。綜合MUC17的表達(dá)和功能，我們推測(cè)MUC17是機(jī)體的保護(hù)因素，其高表達(dá)可抑制腫瘤的惡性行為，延長(zhǎng)患者生存期。

已有研究表明，CDH1基因所編碼的E-cadherin具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能[16]，其低表達(dá)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要事件[17]。利用TCGA數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中MUC17的表達(dá)與CDH1的表達(dá)呈正相關(guān)，提示MUC17可能通過(guò)調(diào)控E-cadherin的表達(dá)抑制胃癌的轉(zhuǎn)移。在下一步研究中我們將闡釋MUC17調(diào)控CDH1表達(dá)的機(jī)制，為揭示胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供新的思路。