唐佳代，劉力萍，龍亞飛，趙益梅，趙騰飛，王芙蓉，李 喆

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564500；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564500）

醬香大曲是以小麥、水和母曲作為生產原料，經過高溫發(fā)酵和貯存而成，用于生產大曲醬香型白酒的糖化發(fā)酵劑[1]。其生產工藝有“制曲黑白黃”一說，即成品曲按照色澤不同分為黃曲、黑曲和白曲，其外觀上具有黃曲皮厚，黑曲、白曲皮薄的特點[2]。黃曲醬香濃郁，糖化力較低；黑曲發(fā)酵品溫高常帶有糊味；白曲醬香弱，但其糖化率高[3]。在醬香大曲生產中，黃曲率常作為成品曲塊質量分析重要指標之一。通過控制制曲工藝提高黃曲率的研究較普遍，而黃曲與黑、白曲間微生物差異并不明晰，不利于應用微生物技術對酒曲進行改良。

大曲微生物組成結構及代謝決定了大曲的品質，醬香大曲中微生物有細菌、酵母、霉菌以及放線菌。胡寶東等[3]利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法對黑、白、黃醬香大曲中微生物計數(shù)，細菌總數(shù)較高，達到107數(shù)量級[3]。細菌在醬香大曲發(fā)酵初期提供釀造所需的酸性環(huán)境，產生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、纖維素酶等豐富多樣的酶系，且具有酯化、促美拉德反應和產生吡嗪類物質等能力，從而促進酒中多種風味物質的形成[4-8]。高通量測序技術具備全面的表現(xiàn)樣品微生物豐度等優(yōu)勢，近年來普遍被應用于釀酒領域中不同香型大曲、酒醅、酒糟的微生物群落結構分析，基于該技術分析醬香大曲中黑、白、黃曲微生物群落結構的報道較少[9-12]。本研究應用高通量測序分析不同感官特性醬香大曲中細菌群落結構，結合3種大曲理化指標，分析其微生物群落結構與理化、發(fā)酵特性的關聯(lián)性。同時，掌握更多醬香型白酒釀造過程中的細菌資源，為探索利用曲源微生物提升大曲的醬香和糖化力等性能奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲（YQ）、黑曲（BQ）、白曲（WQ）：貴州省仁懷市某酒廠出倉曲。樣品采集時間為2020年11月，取樣后分別裝入密封袋，運回實驗室保藏，備用。

氫氧化鈉（分析純）：天津大茂化學試劑廠；乙酸（分析純）：川東化工集團；乙酸鈉（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Zymo Research公司；KOD DNA聚合酶（KOD-401B）（1 U/μL）：東洋紡（上海）生物科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）混合液：東洋紡（上海）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱、HH-8J數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州潤滑電器有限公司；DK-98-Ⅱ電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫(yī)療股份有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同感官特性醬香大曲理化特性分析

按照輕工行業(yè)標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[13]對三種不同感官特性醬香大曲（黃曲、黑曲和白曲）的水分含量、酸度和液化力進行測定。

1.3.2 醬香型大曲中DNA提取、PCR擴增和測序

將醬香大曲樣品送至成都羅寧生物科技有限公司，使用BIOMICS DNA提取試劑盒提取黃曲、黑曲和白曲樣品中的DNA。在細菌16S rRNA V4區(qū)域進行擴增，擴增引物F（5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增用酶為KOD PLUS Neo（KOD-401B），PCR擴增體系（50 μL）：5 μL 10×PCR Buffer for KODPlus-Neo，5 μL 2 mmol/L dNTP，5 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL上游引物U515F，1.5 μL下游引物U806R，5 μL DNA模板，31 μL超純水，1 μL KOD-Plus-Neo。PCR擴增條件為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性2 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，25～30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。擴增產物純化后用2%的瓊脂糖凝膠，每個樣本進行3次重復，取線性期PCR產物等量混合后建庫。進一步在Illumina HiSeq 2500測序平臺開展高通量測序。

1.3.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測序所得序列通過拼接雙端序列、過濾去除低質量序列、使用Uchime算法和Gold數(shù)據(jù)庫去除嵌合體，進而得到有效序列（Effiective Tag）。基于Usearch軟件，使用UPARSE算法在97%的一致性水平上進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類。并基于UCLUST分類法與Silva分類學數(shù)據(jù)庫進行16S rRNA基因序列比對和注釋分析。使用QIIME（V 1.9.0）軟件對樣品Alpha多樣性指數(shù)（Alpha diversity）進行分析，用于衡量Alpha多樣性指標主要有Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)。其中Chao1和ACE指數(shù)用于衡量樣本中物種的豐度，兩者數(shù)值與樣本物種總數(shù)成正比[14]：Chao1主要依據(jù)有單條或雙條序列OTU數(shù)目來判斷物種豐度；ACE指數(shù)依據(jù)有單條序列OTU數(shù)目與出現(xiàn)頻次低于10次的物種來衡量樣本中物種總數(shù)。Shannon和Simpson指數(shù)用于綜合衡量樣本物種多樣性[14]：Shannon指數(shù)表示樣本中各物種和物種間在樣本中分布的均勻性，Shannon數(shù)值與物種均勻性成正比；Simpson指數(shù)衡量樣本中物種多樣性，Simpson指數(shù)與樣本多樣性成正比。

2 結果與分析

2.1 黃曲、黑曲和白曲的感官特性

不同感官特性醬香大曲的感官特性差異見表1。由表1可知，黃曲呈金黃色或棕黃色，曲香濃郁；黑曲呈黑色或棕褐色，帶有糊味；白曲呈麥粉色，有生麥味。制曲過程中，小麥磨碎度、拌料水分適中，入倉堆積處于發(fā)酵倉中層，溶氧較好易形成黃曲。若入倉堆積的曲坯處于發(fā)酵倉中下層，溶氧少，濕氣重，水分大，曲坯發(fā)酵過程中熱曲時間長則易形成黑曲。當入倉堆積時，曲坯處于發(fā)酵倉上層，門窗密封性不好，水分揮發(fā)快，熱曲時間短則易形成白曲。

表1 不同感官特性的醬香大曲Table 1 Sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

2.2 不同感官特性醬香大曲理化特性分析

醬香大曲的理化指標是衡量大曲成熟與否的重要標志，在一定程度上反映大曲品質。3種不同感官特性醬香大曲的理化指標結果見表2。

表2 不同感官特性醬香大曲的理化指標Table 2 Physicochemical indexes of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

水分含量過高會導致大曲生霉，從而導致大曲的質量降低。由表2可知，所測不同感官特性醬香大曲樣品中水分含量由高到低依次為白曲＞黑曲＞黃曲，水分含量分別為白曲12.89%、黑曲12.44%、黃曲11.63%，均低于13%，符合地方標準DB52/T 871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》要求[15]。

酸度是醬香大曲的關鍵性指標之一，是微生物綜合作用的結果，酸度適當可一定程度上抑制雜菌，還可為有益微生物提供適宜的生長繁殖環(huán)境。不同感官特性大曲樣品的酸度由高到低依次為黑曲＞白曲＞黃曲，分別為黑曲0.31 mmol/g、白曲0.262 mmol/g、黃曲0.252 mmol/g。醬香大曲酸度范圍應在0.10～0.35 mmol/g，3種醬香大曲樣品均符合地方標準DB52/T 871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》要求[15]。

液化力是衡量大曲發(fā)酵性能高低的重要指標，液化力高將為產酒、產香奠定物質基礎。不同感官特性大曲樣品液化力由高到低依次為黃曲＞白曲＞黑曲，分別為黃曲1.23 g/（g·h）、白曲0.98 g/（g·h）、黑曲0.84 g/（g·h）。

2.2 不同感官特性醬香型大曲細菌多樣性分析

醬香型大曲樣品提取基因組DNA后，對V4區(qū)進行測序，進行雙端拼接獲得到優(yōu)質序列，優(yōu)質序列再經過濾嵌合體后共獲得308 645條有效序列，平均長度為297 bp。

韋恩圖直觀展現(xiàn)了不同感官特性醬香大曲樣品中的共有OTU和特有OTU[12]。不同感官特性醬香大曲細菌韋恩圖見圖1。由圖1可知，三種樣品共同的OTU有521個，黃曲樣品特有的OTU為370個，白曲樣品特有OTU為146個，黑曲樣品特有OTU為970個。結果表明黃曲YQ、黑曲BQ和白曲WQ樣品中的OTU組成既有相似性又有特異性。

圖1 不同感官特性醬香大曲細菌韋恩圖Fig.1 Venn diagram of bacteria of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

OTU數(shù)稀釋曲線是以樣本中隨機抽取一定數(shù)量序列數(shù)與序列所代表的物種數(shù)繪制的曲線。該曲線反映了樣本物種豐富度隨測序深度的變化趨勢，以及持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率。不同感官特性醬香大曲OTU數(shù)稀釋曲線見圖2。由圖2可知，YQ、WQ和BQ樣品的稀釋曲線前期急劇上升，隨著抽取序列的增加后趨于平緩。表明在抽取序列前期隨著抽取序列數(shù)增加，有大量細菌物種被檢出；當抽取檢測大于20 000個序列后，細菌物種不再隨測序數(shù)量的增加而顯著增多，曲線趨于平緩，表明樣本測序量充分，測序結果能真實反映不同感官特性醬香大曲的細菌多樣性。

圖2 不同感官特性醬香大曲細菌OTU數(shù)稀釋曲線Fig.2 OTU numbers rarefaction curves of bacteria of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

Coverage數(shù)值表示樣本序列覆蓋率：Coverage數(shù)值數(shù)值與樣本中物種被測出的概率成正比，各樣本Coverage數(shù)值均大于0.99，認為測序結果能夠真實的反映樣品物種豐度及物種多樣性[16]。在97%相似度水平下，大曲樣品Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計見表3。由表3可知，三種大曲樣品中黑曲BQ樣品的Chao1、Shannon和Ace指數(shù)均最高，說明黑曲BQ中物種分布較為均勻且檢測出物種總數(shù)最高；Simpson指數(shù)與黃曲YQ接近，說明兩者細菌的多樣性差異較小。細菌群落多樣性由高至低依次為：黑曲BQ＞黃曲YQ＞白曲WQ，細菌總數(shù)由高至低依次為：黑曲BQ＞黃曲YQ＞白曲WQ。

表3 不同感官特性醬香大曲細菌Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Bacteria Alpha diversity indexes of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

2.3 不同感官特性醬香大曲細菌群落結構分析

黃、黑、白曲屬水平上的細菌群落結構分析結果見圖3。由圖3可知，醬香大曲樣品中相對豐度前十的物種有巖石芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、Desmospora、Kroppenstedtia、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、海芽孢桿菌屬（Pontibacillus）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖3 基于屬水平不同感官特性醬香大曲細菌群落結構Fig.3 Bacterial community structure of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics based on genus level

白曲WQ中相對豐度＞1%的包括大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）（36.16%）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）（27.67%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（21.47%）、Desmospora（5.45%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（1.64%）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）（1.56%）。

黃曲YQ中相對豐度＞1%有芽孢桿菌屬（Bacillus）（19.48%）、海芽孢桿菌屬（Pontibacillus）（14.40%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（14.02%）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）（11.43%）、Kroppenstedtia（8.90%）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）（7.40%）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）（4.32%）、Desmospora（3.12%）、巖石芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）（1.56%）、醋菌屬（Acetobacter）（1.15%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）（1.11%）。

黑曲BQ中相對豐度＞1%有羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）（22.21%）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）（11.91%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（10.47%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（6.39%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）（5.39%）、Desmospora（3.03%）、海芽孢桿菌屬（Pontibacillus）（2.34%）、巖石芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）（1.68%）、根瘤桿菌屬（Rhizobacter）（1.37%）。

主成分分析（principal component analysis，PCA）通過將測序多維數(shù)據(jù)進行降維，直觀反映所獲得主成分得分及變量得分，從而實現(xiàn)樣品細菌多樣性相似性可視化[9]。不同感官特性醬香大曲組間PCA分析結果見圖4。

圖4 不同感官特性醬香大曲樣品細菌屬水平群落主成分分析結果Fig.4 Principal component analysis results of the bacterial genus level community of sauce-flavor Daqu samples with different sensory characteristics

由圖4可知，兩個主要成分PC1、PC2分別占49.8%，26.4%，共能解釋76.2%的物種差異。黃曲YQ與白曲WQ、黑曲BQ樣品在橫縱坐標上均有明顯距離，說明黃曲YQ與白曲WQ、黑曲BQ樣品間細菌群落結構在屬水平上有較大差異；白曲WQ與黑曲BQ樣品在第一主成分上距離較小，說明白曲WQ與黑曲BQ樣品間細菌群落結構較為相似。

線性判別分析效應量（linear discriminant analysis effect size，LEfse）可以進行組間類群的差異檢驗，找到在組間差異顯著的物種，也就是對組間差異貢獻大的類群。LEfSe的統(tǒng)計結果的顯著差異物種線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值分布柱狀圖，用以展示每個組內顯著富集的物種及其重要性程度。不同感官特性醬香大曲樣品細菌顯著差異物種線性判別分析見圖5。

圖5 不同感官特性醬香大曲樣品細菌顯著差異物種線性判別分析Fig.5 Linear discriminant analysis of bacteria significantly different species of sauce-flavor Daqu samples with different sensory characteristics

由圖5可知，從不同感官特性醬香大曲中檢出28個細菌類群，其中屬于高相對豐度菌屬的有：黃曲YQ中的海芽孢桿菌屬（Pontibacillus），黑曲BQ中的羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora），白曲WQ中的大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。造成不同感官特性醬香大曲細菌群落結構差異的主要是海芽孢桿菌屬（Pontibacillus）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、大洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和一些相對豐度較低的菌屬。

3 討論

高通量測序結果顯示大曲樣品在Silva分類學數(shù)據(jù)庫比對，鑒別出不同感官特性醬香大曲中主導細菌屬分別是：白曲WQ中為海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）；黃曲YQ中為芽孢桿菌屬（Bacillus）、海芽胞桿菌屬（Pontibacillus）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）；黑曲BQ中為羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）。黃曲YQ主導細菌屬與白曲WQ、黑曲BQ在種類和豐度有明顯差異，白曲WQ和黑曲BQ主導細菌屬均包括枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）。結合主成分分析結果，黃曲YQ與白曲WQ、黑曲BQ中細菌多樣性有較大差異性，而白曲WQ和黑曲BQ的細菌菌屬多樣性較為相似。芽孢桿菌屬（Bacillus）是大曲中常見的功能菌，可產生中性、酸性蛋白酶將原料中蛋白質降解為氨基酸和肽類，既為微生物生長提供營養(yǎng)物質，也為美拉德反應提供原料[8]。芽孢桿菌屬（Bacillus）被證實具有產吡嗪類風味物質能力，特別是甲基類吡嗪化合物，被認為是醬香型白酒中的關鍵風味物質之一[19-21]。黃曲YQ中主導細菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus），其可能與黃曲YQ液化力較高，醬香濃郁相關。有很多研究將大曲中的芽孢桿菌應用于制備醬香強化曲[22-24]。此外，芽孢桿菌屬（Bacillus）可產生有機酸、纖維素酶等，適量的有機酸可使酒曲pH達到微酸性為酵母和霉菌創(chuàng)造生存環(huán)境，纖維素酶可提高出酒率、增加酯含量[25-27]。

為探究三種不同感官特性醬香大曲中細菌群落結構差異，應用LEfse分析進行組間類群的差異檢驗，找到組間差異顯著的物種。分析結果顯示，造成細菌群落結構差異的主要是Pontibacillus、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和一些豐度較低的菌屬。黃曲YQ中造成細菌群落結構差異的菌屬是Pontibacillus，該菌屬曾被證明具有產生α-淀粉酶能力[28]，α-淀粉酶可將淀粉降解為糊精，使淀粉液化，故推測其與黃曲有較好液化力有一定程度相關性。

4 結論

醬香出倉大曲表現(xiàn)為不同感特性，該研究通過理化分析表明，不同感官特性醬香大曲樣品中水分含量、酸度均符合醬香成品的相關標準。黃曲YQ醬香濃郁且液化力較高，達到1.23 g/（g·h）。醬香濃郁可能與黃曲YQ中芽孢桿菌屬（Bacillus）為主導細菌屬相關，而導致黃曲與黑曲、白曲間的液化力差別可能與其差異貢獻較大海芽孢桿菌屬（Pontibacillus）相關。

基于高通量測序技術結合理化指標分析，初步探究了不同感官特性醬香大曲理化特性差異與細菌多樣性與群落結構差異間的關聯(lián)性。進一步將完善不同感官特性醬香大曲中微生物組學與理化特性相關性研究，獲取醬香大曲中功能微生物，為提高醬香大曲發(fā)酵性能奠定理論與物質基礎。