陳 國 龔一富

（1.浙江省慈溪中學(xué) 浙江寧波 315300）

（2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波 315832）

PCR技術(shù)是生物學(xué)考試中的熱點與難點。近年來，隨著PCR技術(shù)的快速發(fā)展，除常規(guī)PCR外，還衍生出了重疊延伸PCR、反向PCR、熒光定量PCR、巢式PCR、不對稱PCR、多重PCR等技術(shù)，不同的PCR技術(shù)有著不同的應(yīng)用。下文選取了教學(xué)中與PCR技術(shù)相關(guān)的疑難點，并結(jié)合典型試題，探討幾種PCR技術(shù)的應(yīng)用，以促進學(xué)生對PCR技術(shù)的理解，并為教師的教學(xué)提供參考。

1 利用PCR技術(shù)獲取目的基因

獲取目的基因是基因工程操作的第一步。新版高中生物學(xué)教材介紹了化學(xué)合成、借助載體建立基因文庫和通過PCR擴增DNA三種獲取目的基因的方法。由于PCR是體外的DNA擴增技術(shù)，部分學(xué)生在學(xué)習(xí)時，對如何利用PCR技術(shù)獲取目的基因存在疑問。

【例1】“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1A所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有5種不同的DNA分子，如圖1B所示，其中第⑤種DNA分子有（ ）個。

圖1 目的基因及PCR產(chǎn)物

參考答案：8

難點分析：若要獲得目的基因X，至少需要3輪PCR，具體過程如圖2所示。第一輪PCR得到2個DNA片段（①和②各一分子）。第二輪PCR得到4個DNA片段（①②③④各一個）。第三輪PCR得到8個DNA片段（①②各1個，③④⑤各2個），其中⑤是等長的，即獲得2個目的基因X。同理，第四輪PCR可得到16個DNA片段，其中8個⑤，實現(xiàn)了目的基因的擴增。

圖2 PCR獲取目的基因

2 利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式

檢測目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟。新版高中生物學(xué)教材介紹了借助載體上的標(biāo)記基因、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等方法鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因。在實際操作中，PCR技術(shù)不僅可精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過引物的巧妙設(shè)計鑒定目的基因的連接方式。

【例2】為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計引物進行PCR鑒定。圖3中A所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是____。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴增出了400 bp片段，原因是______________。

圖3 重組質(zhì)粒

參考答案：乙和丙 目的基因反向連接

難點分析：可以運用PCR技術(shù)檢測鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入目的基因，其簡要的步驟是，首先根據(jù)目的基因的序列設(shè)計PCR引物，接著利用待檢DNA為模板進行PCR，再通過電泳鑒定PCR產(chǎn)物。如圖3所示，如果用引物乙和丙，若正確連接則會產(chǎn)生350 bp片段，反向連接則不會出現(xiàn)；同理，若用引物甲和丙，無論正向連接還是反向連接均會產(chǎn)生450 bp片段。根據(jù)圖3中B進行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向連接會擴增出400 bp片段。

3 利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點突變

隨著PCR技術(shù)的不斷創(chuàng)新，在實驗中，可利用重疊延伸PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點突變，重疊延伸PCR技術(shù)是如何將兩個不同來源的DNA片段拼接的，也是學(xué)生普遍關(guān)心的問題。下面結(jié)合例題進行分析。

【例3】水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）替換為賴氨酸（密碼子為AAA、AAG），從而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如圖4所示。

圖4 PCR定點突變示意圖

（1）若擬突變位點的堿基對為A-T，則需要讓其突變?yōu)開____才能達到目的。引物2的突變位點（突起處）應(yīng)設(shè)計為______（假設(shè)引物為單鏈DNA）。

（2）在第一階段獲得兩種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進行一次復(fù)制，共產(chǎn)生__________種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因為_________________。

（3）利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計這4種引物時，特別要注意的問題是___________________________。

參考答案：（1）T-A或C-G A或G （2）3引物2和引物3中存在互補片段，置于同一反應(yīng)體系時會發(fā)生結(jié)合而失去作用 （3）M1、M2中的一種引物與引物N1、N2的其中一種必須具有互補配對的片段

難點分析：利用重疊延伸PCR技術(shù)實現(xiàn)基因定點突變的設(shè)計思路分為兩步。第一步是重疊，即用具有互補配對片段的引物（圖4中的引物2和3）分別進行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，對應(yīng)圖4中的第一階段；第二步是延伸，即在后續(xù)的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸獲得想要的定點突變的基因，對應(yīng)圖4中的第二階段。

4 利用PCR技術(shù)擴增未知基因序列

應(yīng)用PCR技術(shù)進行基因擴增時，為了便于設(shè)計引物，要求目的基因兩側(cè)的序列是已知的。如果未知序列的內(nèi)側(cè)是已知序列，可否利用PCR技術(shù)擴增外側(cè)的未知基因序列呢？下面結(jié)合例題進行分析。

【例4】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖5（以EcoRⅠ酶切為例）。

圖5 反向PCR示意圖

請據(jù)圖5回答問題。

（1）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的引物必須是_______（從表2引物①②③④中選擇，填編號）。

表2 DNA序列

（2）對產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列單鏈序列中（虛線處省略了部分核苷酸序列），結(jié)果正確的是_______。

A.5′-AACTATGCG——AGCCCTT-3′

B.5′-AATTCCATG——CTGAATT-3′

C.5′-GCAATGCGT——TCGGGAA-3′

D.5′-TTGATACGC——CGAGTAC-3′

參考答案：（1）②④ （2）B

難點分析：由于已知序列的外側(cè)是未知序列（如圖5中待擴增的未知序列），因此無法設(shè)計引物。若要分析出已知序列兩側(cè)的未知序列，設(shè)計引物是關(guān)鍵，可以采用反向PCR技術(shù)。反向PCR的操作步驟可以分為兩步。第一步是連接成環(huán)，即用限制酶切割DNA，用DNA連接酶將其連接成環(huán)，即圖5中Ⅰ酶切和Ⅱ連接過程。第二步是反向擴增，即根據(jù)已知序列設(shè)計一對引物，以環(huán)狀DNA兩條鏈為模板，從已知序列向未知序列方向進行反向擴增，利用TaqDNA聚合酶無法將DNA連接成環(huán)的特點，得到鏈狀DNA，即圖5中Ⅲ擴增過程。本題（1）采用反向PCR擴增未知序列，又因子鏈的延伸方向從5′-3′，可根據(jù)已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和 3′-CGTTACGCATC?GGAGA-5′，設(shè)計對應(yīng)PCR引物是5′-TCATGAGCG?CATAGTT-3′和 5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，本題（2）對產(chǎn)物測序，得到片段F的完整序列，因為片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的兩端，所以5′端應(yīng)該是AATTC，對應(yīng)F片段的開頭，故選B。

5 利用PCR技術(shù)快速檢測病原體

隨著PCR技術(shù)的改進，新冠病毒的核酸片段是通過實時熒光PCR的檢測的。那么，熒光定量PCR的原理究竟是什么？下面結(jié)合例題進行分析。

【例5】新型冠狀病毒是一種單鏈RNA病毒，新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定，請回答以下問題。

（1）首先，從樣本中提取病毒RNA，經(jīng)____酶作用生成cDNA。然后以cDNA為模板進行實時熒光PCR擴增，測定樣品中病毒核酸量。

（2）通過實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針（一小段單鏈DNA，可與目的基因中部分序列特異性結(jié)合）。當(dāng)探針完整時，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqD?NA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測到（圖6A）。

圖6 實時熒光PCR

①當(dāng)樣本中有目的基因時，引物和探針與目的基因退火，通過形成_________而特異性結(jié)合。

②在PCR循環(huán)的________階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測到的熒光強度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈_______關(guān)系。

（3）在通過實時熒光PCR檢測新型冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖6B所示。

①與指數(shù)增長期相比，線性增長期目的基因數(shù)量的增長率下降，原因有______________。

②Ct值的含義：在PCR擴增過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)。因此，當(dāng)樣本中初始模板越多時，Ct值就__。

③某新型冠狀病毒核酸檢測說明書標(biāo)明，Ct≤37判定為陽性，Ct＞40或無Ct值判定為陰性。圖6B所示新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果應(yīng)判定為____________。

（4）陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染?？赡墚a(chǎn)生假陰性的因素有______________（列舉2例）。

參考答案：（1）逆轉(zhuǎn)錄 （2）氫鍵 延伸 正比例 （3）底物濃度下降、酶活性下降 越小 陽性（4）①取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實時熒光PCR檢測閾值 ②樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解 ③病毒發(fā)生變異

難點分析：傳統(tǒng)PCR進行檢測時，擴增后的產(chǎn)物需要進行染色和電泳分離，并且只能作定性分析，應(yīng)用受到限制。實時熒光PCR是指在反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過對擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法（圖6）。其基本原理是：在PCR擴增時，除加入引物外，同時加入特異性的熒光探針，探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。擴增前，探針結(jié)合在DNA單鏈上，因報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒光信號；擴增時，TaqDNA酶將探針降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物定量關(guān)系。