蘆杰 胡海霞 韓中波

1 吉林省臨床檢驗(yàn)中心（吉林省醫(yī)療機(jī)構(gòu)質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)中心）質(zhì)量控制科，長(zhǎng)春 130021；2 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胃腸結(jié)直腸外科，長(zhǎng)春 130033；3 吉林市結(jié)核病防治研究所研究室，吉林 132011

結(jié)核病是重大感染性疾病之一，終身患病風(fēng)險(xiǎn)較大[1]。結(jié)核分枝桿菌入侵機(jī)體早期，患者可通過(guò)自身免疫功能來(lái)控制感染發(fā)展，降低感染率，或使疾病轉(zhuǎn)歸為慢性結(jié)核病[2-3]，免疫功能低下人群則可能發(fā)展成為急性、活動(dòng)性結(jié)核病，部分慢性結(jié)核病患者也可能因免疫功能變化而發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病[4]。因此，檢測(cè)患者免疫功能水平變化能有效評(píng)估患者轉(zhuǎn)歸和預(yù)后結(jié)局，是防治活動(dòng)性結(jié)核病的重要手段。研究認(rèn)為，血清中高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）表達(dá)水平與免疫反應(yīng)時(shí)組織損傷和炎癥程度有關(guān)，血清中的中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR） 也反映了全身炎癥和免疫之間的平衡[5-6]。此外，研究表示38 000 蛋白為結(jié)核分枝桿菌抗原之一，可用其診斷活動(dòng)性結(jié)核病和感染程度[7]。本研究探討了HMGB1 和NLR 水平與活動(dòng)性結(jié)核病患者細(xì)胞免疫功能及結(jié)核分枝桿菌38 000 蛋白的關(guān)系，旨在為活動(dòng)性結(jié)核病臨床診治提供參考。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2019年1月至2021年6月吉林市結(jié)核病防治研究所收治的60 例活動(dòng)性肺結(jié)核患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288—2017）》中對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即痰結(jié)核菌檢查陰性，X線檢查肺部有滲出性病變、干酪性病變并周邊滲出性病變、空洞、增殖性病變，臨床表現(xiàn)為低熱、咳嗽、消瘦、乏力等[8]；（2）原發(fā)性肺結(jié)核，且為初治；（3）無(wú)除肺結(jié)核以外的肺部疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他類型的結(jié)核?。ńY(jié)核性腹膜炎、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性心包炎、腸結(jié)核）；（2）有實(shí)質(zhì)性組織器官嚴(yán)重?fù)p傷或功能障礙、免疫疾病史、凝血造血功能障礙史、嚴(yán)重腫瘤疾病史；（3）近期使用細(xì)胞毒性類或免疫抑制類藥物；（4）處于妊娠期或哺乳期，或有精神疾病、或認(rèn)知障礙不配合研究工作、依從性較差。本研究經(jīng)吉林市結(jié)核病防治研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：L1901003），所有研究對(duì)象均知情同意。

二、分組情況

納入60 例活動(dòng)性結(jié)核患者為A 組，男39 例，女21 例；年齡（45.92±5.26）歲，范圍34～58 歲；體質(zhì)量指數(shù)（21.99±1.48） kg/m2，范圍18.53～25.74 kg/m2；輕度結(jié)核26 例，中度結(jié)核16 例，重度結(jié)核18 例。另選擇同期收治的60 例非活動(dòng)性肺結(jié)核病患者為B 組，男35 例，女25 例，年齡（46.33±5.03）歲，范圍36～57 歲；體質(zhì)量指數(shù)（21.82±1.74） kg/m2，范圍（18.94～24.85） kg/m2；輕度結(jié)核30 例，中度結(jié)核16例，重度結(jié)核14 例。選擇60 例健康志愿者設(shè)為C組，男35 例，女25 例；年齡（46.33±5.03）歲，范圍36～57 歲，體質(zhì)量指數(shù)（21.82±1.74）kg/m2，范圍（18.94～24.85） kg/m2。三組在性別（χ2=0.74，P=0.689）、年齡（F=0.58，P=0.560）和體質(zhì)量指數(shù)（F=3.01，P=0.078）等基礎(chǔ)資料方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

三、研究指標(biāo)

兩組患者于就診當(dāng)天，抽取外周靜脈血10 mL，置于離心機(jī)（北京祥生興業(yè)科技有限公司）中以3 000 r/min（離心半徑為12.5 cm）離心10 min，取上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HMGB1 水平，所有試劑均來(lái)源于HMGB1 ELISA 試劑盒 （上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。使用COULTER LH 780/LH 785血細(xì)胞分析儀[貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]檢測(cè)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，中性粒細(xì)胞百分比正常范圍為40%～75%，淋巴細(xì)胞百分比正常范圍為20%～40%，計(jì)算NLR 水平。使用DxFLEX流式細(xì)胞儀[貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]檢測(cè)血清樣本中的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+，其正常范圍分別為50%～84%，27%～51%，15%～44%，0.71～2.78[9]。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌38 000 蛋白，試劑盒購(gòu)自上海欽誠(chéng)生物科技有限公司，該試劑中的結(jié)核分枝桿菌能夠捕獲血清中的含結(jié)核IgG 抗體，與葡萄球菌A 蛋白結(jié)合形成特異性紅色斑點(diǎn)，若檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性[10]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov（K-S）檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，符合方差齊性使用Tukey HSD 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，不符合方差齊性使用Tamhane’s T2進(jìn)行多重比較； 不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 或Spearman 相關(guān)分析對(duì)HMGB1、NLR 和活動(dòng)性結(jié)核病患者的細(xì)胞免疫功能水平和結(jié)核分枝桿菌38 000 蛋白的相關(guān)性進(jìn)行分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、3 組患者HMGB1 和NLR 水平比較

3 組患者的HMGB1（F=101.72，P＜0.001）、中性粒細(xì)胞百分比（F=278.56，P＜0.001）、淋巴細(xì)胞百分比（F=567.80，P＜0.001）、NLR（F=727.79，P＜0.001）以及38 000 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（χ2=74.30，P＜0.001）組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中HMGB1、中性粒細(xì)胞百分比、NLR、結(jié)核分枝桿菌38 000 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均為A 組＞B 組＞C 組； 淋巴細(xì)胞百分比為A組＜B 組＜C 組。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同組別人群HMGB1 和NLR、38 000 蛋白比較

二、不同組別患者細(xì)胞免疫功能比較

3 組患者CD3+（F=697.61，P＜0.001）、CD4+（F=450.93，P＜0.001）、CD8+（F=427.89，P＜0.001）和CD4+/CD8+（H=92.01，P＜0.001） 細(xì)胞水平比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，CD3+和CD4+水平為A 組＜B 組＜C 組，CD8+細(xì)胞水平為A 組＞B 組＞C 組。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同組別人群細(xì)胞免疫功能比較

三、HMGB1、NLR 與細(xì)胞免疫功能、38 000 蛋白的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，CD3+、CD4+和CD4+/CD8+細(xì)胞水平與HMGB1 和NLR 呈負(fù)相關(guān)（P<0.001），CD8+、38 000 蛋白與HMGB1 和NLR 呈正相關(guān)（P<0.001）。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 HMGB1、NLR 與細(xì)胞免疫功能及38 000 蛋白相關(guān)性

討論

活動(dòng)性結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展與患者機(jī)體免疫水平密切相關(guān)。HMGB1 具有較強(qiáng)的致炎活性，NLR 則與身體的免疫狀況以及炎癥表達(dá)密切相關(guān)[5-6]，了解其與活動(dòng)性結(jié)核病患者的免疫相關(guān)指標(biāo)和結(jié)核分枝桿菌38 000 蛋白之間的關(guān)系，可更全面地評(píng)估患者的免疫功能和感染程度。

一、HMGB1 和NLR 水平在不同免疫水平人群中有差異

本研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性結(jié)核病患者體內(nèi)HMGB1的表達(dá)水平高于非活動(dòng)性結(jié)核病患者及健康者，推測(cè)其可能是由被結(jié)核分枝桿菌感染的免疫細(xì)胞釋放，從而導(dǎo)致表達(dá)水平升高。

中性粒細(xì)胞是機(jī)體重要的天然免疫細(xì)胞，具有識(shí)別和吞噬入侵機(jī)體的結(jié)核分枝桿菌的作用[11]。研究證明，免疫功能紊亂的活動(dòng)性結(jié)核病患兒外周血淋巴細(xì)胞整體數(shù)量低于健康兒童[12]。本研究結(jié)果也表明，活動(dòng)性結(jié)核病患者的NLR 水平較非活動(dòng)性結(jié)核病及健康者高。

二、HMGB1 和NLR 水平與結(jié)核病患者免疫功能及38 000 蛋白呈一定相關(guān)性

HMGB1 對(duì)結(jié)核病患者發(fā)生肝損傷具有一定的預(yù)測(cè)作用[13]，這同時(shí)伴隨一定的炎癥反應(yīng)，炎癥與免疫的失衡致使HMGB1 水平變化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1 水平越高，CD3+、CD4+和CD4+/CD8+細(xì)胞占比越低，CD8+細(xì)胞占比越高，免疫功能受損嚴(yán)重。結(jié)核分枝桿菌38 000 蛋白是結(jié)核分枝桿菌抗原之一，含有特異性的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原決定簇，可誘導(dǎo)早期免疫反應(yīng)[7]。隨著肺結(jié)核患者病情的加重，患者NLR 和結(jié)核分枝桿菌38 000 蛋白水平也逐漸升高[15]，本研究也發(fā)現(xiàn)NLR 和結(jié)核分枝桿菌38 000蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈顯著相關(guān)性，因此，檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病患者外周血NLR 能有效評(píng)估其細(xì)胞免疫功能變化[16]。

綜上所述，HMGB1 表達(dá)水平和NLR 可反映活動(dòng)性結(jié)核病患者細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，可用其評(píng)估患者的免疫能力，為治療提供指導(dǎo)依據(jù)。本研究也有一定的局限性，包括HMGB1 表達(dá)水平和NLR 參與影響活動(dòng)性結(jié)核患者細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的分子生物學(xué)機(jī)制等有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明蘆杰：論文設(shè)計(jì)、整理和撰寫(xiě)；胡海霞：資料收集、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析；韓中波：指導(dǎo)和修改稿件