易華娟，蘇雍倫，何潔玲，張樹權(quán)，陳錦杭

（1.東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 523808；3.中山海關(guān)技術(shù)中心，廣東 中山 528403）

汞（Hg）是一種常見的高毒性元素，具有持久性、全球性和生物累積性[1]，主要分為無機(jī)態(tài)（Hg，Hg2+，Hg+）和有機(jī)態(tài)（MeHg、乙基汞（EtHg）等）[2]，有機(jī)汞的毒性較無機(jī)汞更強(qiáng)，其中MeHg的毒性最強(qiáng)[3]。Hg主要以氣態(tài)形式存在于大氣中，其中的無機(jī)汞因重力、雨水等原因進(jìn)入地表[4]，同時(shí)水體因各種生產(chǎn)活動(dòng)而被Hg污染，水中的無機(jī)汞經(jīng)過微生物作用轉(zhuǎn)換為MeHg[5-6]。MeHg因其碳鏈短、分子量小、脂溶性大而極易被魚類吸收，而MeHg排除的速率卻很低，并因生物累積效應(yīng)在生物體內(nèi)富集，富集因子高達(dá)1×104～1×107[2]。所以，即使在低濃度MeHg的水里，還是能夠引起魚類的高水平污染，這最終都會(huì)反饋給食用者[7]。魚飼料在生產(chǎn)及儲(chǔ)存過程中會(huì)因復(fù)雜的環(huán)境、原材料及生產(chǎn)器械等而被甲基汞污染[8]。

研究指出，人類暴露于MeHg的主要途徑為食用水產(chǎn)品[7-9]，甲基汞沿著食物鏈中的細(xì)菌、浮游生物等富集到魚類中，被人類食用后，會(huì)被人體吸收并隨血液輸送到全身組織器官中[10]。中毒表現(xiàn)主要為末梢感覺紊亂、精神失常、喪失意識、震顫、共濟(jì)失調(diào)和向心性失調(diào)等[11]。上世紀(jì)50年代，日本“水俁事件”的成因就是食物鏈被MeHg污染[12]。因此，研究食物鏈中MeHg的累積效應(yīng)對保護(hù)人類健康具有重要意義。

我國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國，同時(shí)也是汞污染較為嚴(yán)重的國家[13-14]，隨著養(yǎng)殖業(yè)的商業(yè)化，魚飼料在投料中所占比例也越來越高，魚飼料的污染水平將是控制水產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵[15]。目前，國內(nèi)外對水生食物鏈中甲基汞的放大作用主要集中在不同營養(yǎng)層間的捕食關(guān)系上[16]，鮮有研究魚飼料在食物鏈中的累積效應(yīng)。通過對不同魚體、飼料的深入分析，能夠使人們對甲基汞在不同魚體中的分布狀況有一定的認(rèn)識，同時(shí)也為后續(xù)對于魚飼料中甲基汞的研究提供借鑒。

目前，液相和氣相色譜等分離方法與原子熒光光譜[17-18]、原子吸收光譜、原子發(fā)射光譜[19]和電感耦合等離子質(zhì)譜[20-22]等高靈敏度的檢測儀器聯(lián)用被廣泛應(yīng)用于甲基汞的檢測研究中[23]。但這些方法因成本高、前處理繁雜、耗時(shí)長、分析效果不理想等原因，限制了其在日常批量檢驗(yàn)中的使用。研究采用了吹掃捕集-氣相色譜-冷原子熒光光譜儀法，該方法具有操作簡便、檢出限低、分離效果佳、時(shí)間短和成本低等優(yōu)勢[24-25]。隨著檢測行業(yè)的發(fā)展和國家標(biāo)準(zhǔn)的完善，GC-CVAFS法在日常檢測中的推廣必定更具發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯇魚、草魚、烏鱧、鯉魚、鳙魚、多春魚、帶魚、鲅魚、黃花魚、鮸魚和魚飼料，購自市場。

氫氧化鉀、三水合乙酸鈉（優(yōu)級純）、冰乙酸（色譜純），中國天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；鹽酸（優(yōu)級純）、硝酸（分析純），廣州試劑廠提供；甲醇（色譜純），德國默克公司提供；四乙基硼化鈉（≥98%）；魚肉中總汞與甲基汞成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)值5.5±0.17 mg/kg），歐盟聯(lián)合研究中心提供；甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/L），中國計(jì)量科學(xué)研究院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)甲基汞測定分析儀，美國Brooks Rand Labs公司產(chǎn)品；渦旋振蕩儀，德國IKA公司產(chǎn)品；烘箱，德國Memment公司產(chǎn)品；電子分析天平，北京Satorious科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；微量移液器，德國艾本德有限公司產(chǎn)品；超純水處理系統(tǒng)，美國密理博產(chǎn)品。

1.3 試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 20%（W/V）氫氧化鉀（KOH）甲醇溶液

稱取10.0 g KOH置于50 mL離心管中，分4次加入40 mL甲醇溶解，混勻，裝聚四氟乙烯試劑瓶內(nèi)保存。

1.3.2 乙酸鈉（NaAc-HAc）緩沖溶液（2 mol/L）

稱取54.4 g三水合乙酸鈉，加入到23.6 mL冰乙酸中，用水定容至200 mL。

1.3.3 30%硝酸溶液

量取30 mL硝酸，加入至70 mL水中；2%（W/V）KOH水溶液：稱取1.0 g KOH置于50 mL塑料容量瓶中，加水溶解并定容至50 mL。

1.3.4 乙基化試劑

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的KOH溶液置于-20℃冰箱中凍至水溶液出現(xiàn)晶體后，加入0.5 g四乙基硼化鈉粉末，混勻后分裝到液相小瓶中，置于-20℃下保存。

1.3.5 0.5%乙酸+0.2%鹽酸混合溶液

量取0.5 mL乙酸溶液和0.2 mL鹽酸溶液，緩緩倒入100 mL水中。

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 pg/mL)：吸取相應(yīng)量的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.5%乙酸+0.2%鹽酸混合溶液逐級稀釋至質(zhì)量濃度為200 pg/mL，置于4℃以下冰箱儲(chǔ)存使用。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取前準(zhǔn)備

將魚樣用水洗凈，取可食部分放入攪拌器中絞碎、混勻，裝入樣品罐中，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?；取顆粒狀魚飼料放入攪拌器中絞碎至粉末狀、混勻，裝入樣品罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 堿法提取

稱取0.1 g（精確到0.000 1 g）樣品到50 mL離心管中，加入預(yù)先配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的KOH甲醇溶液5 mL，搖勻后置于60℃的烘箱中消解4 h。消解過程中，每隔1 h渦旋1次，使消解液與樣品充分接觸。在進(jìn)樣瓶中加水至瓶頸處，加入樣品消解液50 μL，用10% HCl試劑調(diào)節(jié)pH值至6～8，加入NaAc-HAc緩 沖溶液300 μL，將pH值調(diào)節(jié)至4.5～5.0，加入乙基化試劑50 μL，加水至出現(xiàn)凸液面，迅速蓋上瓶蓋，搖勻，使其乙基化反應(yīng)充分進(jìn)行。

1.4.3 酸法提取

稱取0.1 g（精確到0.000 1 g）樣品到50 mL離心管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的硝酸溶液10 mL，蓋緊，置于60℃烘箱中消解12 h。取出消解完的樣品，加水定容至20 mL。在進(jìn)樣瓶中加水至瓶頸處，準(zhǔn)確移取0.2 mL樣品消解液至瓶內(nèi)，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的KOH甲醇溶液0.16 mL，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HCl溶液試劑調(diào)節(jié)pH值至6～8，加入NaAc-HAc緩沖溶液將pH值調(diào)節(jié)至4.5～5.0，加入50 μL的乙基化試劑，加水至出現(xiàn)凸液面，迅速蓋上瓶蓋，搖勻，使其乙基化反應(yīng)充分進(jìn)行。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

將40 mL棕色進(jìn)樣瓶加水至瓶頸處，分別移取0.2 ng/mL甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05，0.25，0.50，1.25，2.50，5.00 mL，加入NaAc-HAc緩沖溶液300 μL，再加入乙基化試劑50 μL，加水至呈凸液面，蓋緊混勻，配成甲基汞質(zhì)量分別為10，50，100，250，500，1 000 pg的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.6 儀器條件及原理

1.6.1 儀器條件

冷原子熒光檢測器光電倍增管（PMT）電壓670 V；基線信號值36 μV；吹掃捕集氣：氮?dú)?，流?0 mL/min，時(shí)間5 min；干燥氣：氮?dú)?，流?0 mL/min，時(shí)間3 min；Tenax管解析加熱時(shí)間9.9 s；GC溫度35℃；GC載氣為氬氣，流速30 mL/min。

1.6.2 儀器工作原理

全自動(dòng)烷基汞測定分析儀的儀器檢出限（IDL）為0.002 ng/L，其工作原理為：將樣品經(jīng)前處理消解提取出甲基汞，取定量樣液進(jìn)行乙基化反應(yīng)后，在加壓狀態(tài)下被氮?dú)庾詣?dòng)輸送至氣液分離器中，經(jīng)氮?dú)獯得撝罷enax捕集管并被干燥，加熱Tenax捕集管使Hg解析，而后被氬氣輸送至氣相柱使不同形態(tài)的Hg分離，熱解還原為單質(zhì)Hg，經(jīng)冷原子熒光檢測器（CVAFS）進(jìn)行測定[26]。

陽性樣品出峰色譜圖見圖1。

圖1 陽性樣品出峰色譜圖

色譜圖中包含3個(gè)峰，從左到右依次為Hg0，MeHg，Hg2+和CH3-CH2-Hg+。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC柱分離溫度的優(yōu)化

取衍生好的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品，設(shè)定GC溫度為30，35，40，45℃，比較不同溫度下Hg0，MeHg，Hg2+和CH3-CH2-Hg+乙基化產(chǎn)物的分離效果。由圖1可知，溫度為45℃時(shí)，3個(gè)峰勉強(qiáng)分離；當(dāng)溫度為30，35，40℃時(shí)，3個(gè)峰可以完全分離開；但溫度為30℃時(shí)，MeHg的峰拖尾時(shí)間較長，不利于快速檢測；所以，當(dāng)溫度為35℃和40℃時(shí)，3個(gè)峰的分離效果最好，考慮到經(jīng)濟(jì)效益及環(huán)保節(jié)能，選取35℃作為GC柱的分離溫度最為合適。

2.2 乙基化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 乙基化反應(yīng)的pH值

用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)作為質(zhì)控樣品，按照1.4.2中堿法消解的步驟對樣品進(jìn)行前處理，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HCl溶液試劑調(diào)節(jié)pH值至6～8后，加入濃度為2 mol/L的NaAc-HAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至3，4，5，6，8，9，10，每個(gè)pH值條件做6組平行。

乙基化反應(yīng)pH值對回收率的影響（n=6）見圖2。

圖2 乙基化反應(yīng)pH值對回收率的影響(n=6)

回收率在pH值5時(shí)最高，此時(shí)添加的2 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液為300 μL，回收率為99.927%。研究所得的最佳乙基化反應(yīng)pH值與王雪婷等人[27]的研究結(jié)果相符。

2.2.2 乙基化試劑的使用量

乙基化試劑的使用量對乙基化反應(yīng)有直接影響，乙基化試劑使用量過少時(shí)甲基汞的乙基化反應(yīng)不充分，但使用量過大時(shí)又會(huì)使得乙基化反應(yīng)劇烈造成甲基汞揮發(fā)而損失，回收率下降，同時(shí)也會(huì)提高試驗(yàn)成本[28]。因此，確定最佳的乙基化試劑使用量尤為重要。

用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)作為質(zhì)控樣品，按照1.4.2中堿法消解的步驟對樣品進(jìn)行前處理，分別加入乙基化試劑20，40，50，70 μL，測定其含量。

不同乙基化試劑使用量時(shí)標(biāo)樣中MeHg的測定值（n=6）見表1。

表1 不同乙基化試劑使用量時(shí)標(biāo)樣中MeHg的測定值（n=6）

由表1可知，乙基化試劑的投加量為40 μL和50 μL時(shí)，標(biāo)樣的測定值都在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，為確保樣品中的乙基化反應(yīng)充分進(jìn)行，試驗(yàn)選取的乙基化試劑投加量為50 μL。

2.3 消解方法的比較

在生物組織中，有機(jī)汞的含量占總汞的70%～90%，有機(jī)汞化合物與硫基高度親和[29]，必須通過化學(xué)試劑破壞硫化合物，從而釋放有機(jī)汞。不同的提取方式對MeHg的回收率和不同形態(tài)Hg之間的轉(zhuǎn)換會(huì)產(chǎn)生不同的效果。因此，樣品的前處理方法對于檢測結(jié)果中的質(zhì)量控制至關(guān)重要。

2.3.1 魚肉消解方法的選擇

稱取魚肉中甲基汞成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作進(jìn)行試驗(yàn)，分別按照1.4中的酸法和堿法對樣品進(jìn)行消解。

2種消解方法處理魚肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果對比（n=3）見表2。

表2 2種消解方法處理魚肉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果對比（n=3）

由表2可知，2種方法的回收率相差不大，測定值均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，因此2種前處理方法均適用于魚類中甲基汞的測定?？紤]到堿法消解的前處理時(shí)間相較于酸法消解短，接下來魚類中甲基汞的測定均采用堿法消解。

2.3.2 魚飼料消解方法的選擇

分別按照1.4中的堿法和酸法對樣品進(jìn)行前處理。

2種消解方法處理魚飼料的結(jié)果對比（n=6）見表3。

表3 2種消解方法處理魚飼料的結(jié)果對比（n=6）

魚飼料的基質(zhì)較為復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)原料，如魚粉、蝦粉、豆粕和米糠等。魚飼料消解完成后，發(fā)現(xiàn)酸法的消解液沉淀少、呈澄清狀態(tài)，而堿法處理魚飼料樣品的消解液中出現(xiàn)乳濁、顆粒性沉淀現(xiàn)象及少量泡沫。酸法消解的RSD%為2.92%，具有良好的平行性；堿法消解的RSD%為9.81%，且提取效率顯著低于酸法消解（p＜0.05）。

由消解現(xiàn)象及測定結(jié)果可知，相比于堿法消解，酸法消解能較完全地消解魚飼料樣品并提取甲基汞，因此接下來的試驗(yàn)中魚飼料采取酸法消解。

2.4 線性關(guān)系

質(zhì)量分別為10，50，100，250，500，1 000 pg的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化條件下測定，以MeHg的出峰高度為縱坐標(biāo)（Y），MeHg質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），作線性回歸曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=365.68X-1 900.2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

2.5 方法檢出限與定量限

以11個(gè)空白樣品考查該方法的靈敏度，計(jì)算11個(gè)空白樣品測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限。根據(jù)樣品前處理方法中的稱樣量和稀釋倍數(shù)，可計(jì)算出方法的檢出限和定量限。

不同消解方法的檢出限和定量限見表4。

表4 不同消解方法的檢出限和定量限

2.6 方法精密度與準(zhǔn)確度

分別選取草魚和魚飼料作為試驗(yàn)材料，以1倍，2倍及10倍定量限作為加標(biāo)水平。分別按照1.4中的堿法和酸法對樣品進(jìn)行消解及測定。每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行試驗(yàn)。

魚肉中甲基汞加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果（n=6）見表5，魚飼料甲基汞加標(biāo)回收率和精密度（n=6）見表6。

表5 魚肉中甲基汞加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果（n=6）

表6 魚飼料甲基汞加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和RSD均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中附錄F的要求，定量限適用性良好。

2.7 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用研究建立的分析方法對10種魚類和10批魚飼料進(jìn)行測定。

魚及魚飼料中甲基汞含量的測定結(jié)果（n=6）見表7。

由表7可知，淡水魚測定含量為3.79～16.74 μg/kg，海水魚測定含量為26.45～142.19 μg/kg。魚飼料中2批檢出甲基汞的含量范圍為3.68 μg/kg和5.51 μg/kg。GB 2762—2017《食品中污染物限量》中MeHg限量規(guī)定：肉食性水產(chǎn)動(dòng)物及其制品1.0 mg/kg，非肉食性魚類及其制品0.5 mg/kg，在此次測定中所有水產(chǎn)品的MeHg含量均符合該限量要求。

表7 魚及魚飼料中甲基汞含量的測定結(jié)果（n=6）

從結(jié)果大致可知，海水魚的甲基汞含量普遍高于淡水魚中的甲基汞含量，造成這種差異的原因可能是生活環(huán)境和食物中甲基汞濃度的不同。海水魚多數(shù)是野生的且生長周期長，在海水中有較長且穩(wěn)定的食物鏈，對于甲基汞的富集作用強(qiáng)。而淡水魚一般是養(yǎng)殖魚，淡水中的甲基汞污染沒有海水中的污染嚴(yán)重，且能夠人為控制，并且主要以甲基汞含量極低的魚飼料作為主要食物來源，生長周期短，食物鏈短，富集MeHg的程度低[30]。

3 結(jié)論

建立了氣相色譜-冷蒸氣原子熒光光譜法測定魚及魚飼料中甲基汞的方法，該方法靈敏度高，操作步驟簡便快速、準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)可行，分析測定得到的數(shù)據(jù)具有良好的精密度，準(zhǔn)確性高，在日常檢測中具有很大的推廣空間和發(fā)展前景。