林長高，劉 林，王 輝，隗黎麗

（江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，江西 南昌 330045）

【研究意義】目前普遍認為魚類的生理和物種差異、遺傳和基因突變、營養(yǎng)素攝入不均衡、能量攝入過度以及養(yǎng)殖環(huán)境中污染物可干擾魚類的脂質(zhì)代謝，從而造成魚類脂肪嚴重沉積[1]。結(jié)合現(xiàn)有的研究報道，學者們主要從營養(yǎng)與飼料的角度對魚類脂質(zhì)代謝進行了研究，而環(huán)境污染物影響魚類脂質(zhì)代謝的研究相對較少。近年來，隨著水體環(huán)境污染日益嚴重，養(yǎng)殖水體中的環(huán)境污染物對養(yǎng)殖魚類脂肪沉積的影響也引起了研究者們的重視?！厩叭搜芯窟M展】微囊藻毒素（microcystins，MCs）是富營養(yǎng)化水體中有毒藍藻細胞所產(chǎn)生的一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物，也是水體環(huán)境常見的污染物。到目前為止，發(fā)現(xiàn)已知結(jié)構(gòu)的MCs 變體多達100 余種，其中微囊藻毒素-LR（microcystins-LR，MC-LR）是目前已知的毒性最強的一種淡水藍藻毒素[2]。MC-LR 的主要作用靶器官是肝臟，有關(guān)MC-LR 肝毒性的機制已經(jīng)成為學術(shù)界研究的熱點問題。Wu等[3]研究表明MC-LR 可誘導小鼠肝臟原代細胞中ROS的過量產(chǎn)生，導致肝細胞氧化損傷、凋亡及壞死。Zhan等[4]則指出MC-LR 可觸發(fā)斑馬魚肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引起肝臟細胞凋亡。亦有研究表明MC-LR 暴露可對小鼠肝臟不飽和脂肪酸的生物合成及PPAR 代謝通路造成影響，最終導致脂質(zhì)代謝紊亂[5]?！颈狙芯壳腥朦c】在筆者之前的研究中，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果主要對免疫及凋亡相關(guān)的通路及基因進行了報道[6]，然而深入挖掘數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，MC-LR 對草魚肝臟脂質(zhì)代謝也有明顯的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)合前期已獲得MC-LR 誘導后草魚肝臟轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[6]，重點對脂質(zhì)代謝相關(guān)通路和差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行深入分析，為進一步了解MCLR對魚類脂質(zhì)代謝的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要試劑

試驗用草魚購于江西省南昌神龍漁業(yè)公司，平均體質(zhì)量為（22.13±2.17）g。試驗草魚買回后先在室內(nèi)暫養(yǎng)2 周，暫養(yǎng)期間每日按照魚體質(zhì)量的2.0%進行投喂，并保持水溫在（20±0.2）℃。實驗用MC-LR（純度≥95%），購自Taiwan Algal Science Inc 公司，RNA 提取試劑盒TRIzol reagent 購于Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 和SYBR Green Real-time PCR Master Mix 購于Promega公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗魚處理及樣品采集 草魚在實驗室暫養(yǎng)2 周后，挑選體質(zhì)健康的草魚隨機分成4 個組（包括1 個對照組和3 個MC-LR 實驗組），每組設(shè)3 個平行組。隨后將購買的MC-LR（純度≥95%，Taiwan Algal Science Inc）用0.8%生理鹽水溶解稀釋成25，75，100μg/kg 3 個劑量。采用腹腔注射染毒，注射量為0.1 mL/尾；對照組每尾草魚經(jīng)腹腔注射等量的0.80%的生理鹽水。在染毒96 h 后，分別從實驗組和對照組中各取6 尾魚分離肝臟，每個組3 尾魚混合成1 個樣置于液氮中保存。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序與分析 取液氮中保存的草魚肝臟組織按照TRIzol reagent（Invitrogen）操作說明進行總RNA 的提取，用15 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA 是否存在降解和污染，通過紫外分光光度計Nanno-Photometer（LabTech，USA）檢測提取的總RNA 的純度。將符合要求的總RNA 送交北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司，其中每個組送2 個重復(fù)樣品，構(gòu)建的8 個cDNA 文庫采用IlluminaHiseq-2500 平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)整理分析，然后將獲得的Clean Reads 采用HISAT（version 0.1.6）與草魚基因組（草魚基因組下載地址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）進行比對分析，再根據(jù)FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）方法計算各樣本間基因的差異表達，隨后根據(jù)差異表達基因進行基因功能注釋及富集分析[6]。

1.2.3 熒光定量PCR分析 為了驗證MC-LR 對草魚肝臟轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，在差異基因數(shù)據(jù)庫中隨機挑選3 個基因，利用Primer 5.0 設(shè)計引物（表1），分析熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果是否與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。取轉(zhuǎn)錄組測序剩余的RNA 樣品，其中對照組和實驗組均有2個重復(fù)，采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后將cDNA 模板稀釋10 倍保存于-20 ℃?zhèn)溆?。熒光定量PCR 采用CFX96 Touch?Real-Time PCR Detection System，反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix，2.0μL稀釋的cDNA模板，上下游引物分別各0.5μL（20μmol/L），加ddH2O 補充至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃變性5 min；95 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，40 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。每個樣品的定量分析重復(fù)3 次，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物Tab.1 Primers of quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)的KEGG通路

對照組和3 個MC-LR 實驗組的clean reads 數(shù)據(jù)為4.1×107～5.6×107，與對照組相比，25，75，100μg/kg實驗組的差異表達基因分別有953、4 729和2 265個，其中表達上調(diào)的基因分別有574、2 498和1 472個，表達下調(diào)的基因分別有379、2 231 和793 個，3 個MC-LR 實驗組共同的上調(diào)表達基因有320 個，下調(diào)的 有137 個[6]。

通過KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，25μg/kg 實驗組草魚肝臟暴露96 h 后，DEGs 富集在12 條脂質(zhì)代謝相關(guān)通路上，而在75μg/kg和100μg/kg實驗組中，DEGs富集在15條脂質(zhì)代謝通路上，與25μg/kg實驗組脂質(zhì)代謝通路相比，還富集了不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸延長和脂肪酸合成代謝3條脂質(zhì)代謝通路（表2）。

表2 MC-LR對草魚肝臟脂質(zhì)代謝通路的影響Tab.2 The effects of MC-LR on the lipid metabolism of grass carp liver

2.2 脂質(zhì)代謝通路中的DEGs

2.2.1 不同劑量MC-LR 對草魚肝臟脂質(zhì)代謝通路差異表達基因的影響 根據(jù)表2 可知，25μg/kg 實驗組草魚肝臟中涉及到的脂質(zhì)代謝通路上的DEGs 為37 個。其中脂肪酸合成通路、不飽和脂肪酸合成通路以及脂肪酸延長通路上均未富集DEGs。脂肪酸降解通路、初級膽汁酸合成通路和酮體的合成與降解通路均有1 個DEGs，醚脂類代謝通路、類固醇合成通路、亞油酸代謝通路和鞘脂類代謝通路中均有2 個DEGs，甘油酯代謝通路和花生四烯酸代謝通路中有5個DEGs，甾類激素生物合成通路有7個DEGs，甘油磷脂代謝通路則出現(xiàn)8個DEGs。

75μg/kg 實驗組草魚肝臟中脂質(zhì)代謝DEGs 上升至363 個，其中脂肪酸合成代謝、不飽和脂肪酸合成通路、脂肪酸延長通路以及脂肪酸降解通路均富集了大量DEGs，這4 個通路上分別有10、23、21 和40 個DEGs。初級膽汁酸合成通路有19 個DEGs，甘油酯代謝通路有37 個DEGs，甾類激素生物合成通路有50 個DEGs，花生四烯酸代謝通路有35 個DEGs，甘油磷脂代謝通路有45 個DEGs，醚脂類代謝通路有16 個DEGs，類固醇合成通路有9 個DEGs，亞油酸代謝通路有14 個DEGs，鞘脂類代謝通路有28 個DEGs，酮體的合成與降解有5個DEGs。

100μg/kg實驗組草魚肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因有132個發(fā)生了顯著變化，其中脂肪酸合成代謝、不飽和脂肪酸合成通路、脂肪酸延長通路以及脂肪酸降解通路分別有6、12、9和13個基因有顯著變化。甘油磷脂代謝通路有19 個DEGs，甘油酯代謝通路和甾類激素生物合成通路均有14 個DEGs，鞘脂類代謝通路有12 個DEGs，花生四烯酸代謝通路和醚脂類代謝通路均有8 個DEGs，類固醇合成通路有7 個DEGs，初級膽汁酸合成通路有6個DEGs，而亞油酸代謝通路和酮體的合成與降解通路均只有1個DEGs。

2.2.2 不同劑量MC-LR暴露下草魚肝臟共同的脂質(zhì)代謝差異表達基因 由表2可知，經(jīng)不同劑量MC-LR處理后，有12 個基因在3 個實驗組中表達同時上調(diào)（表3），有14 個基因在3 個劑量組中表達同時下調(diào)（表3）。其中表達上調(diào)的基因主要有：SMPD2、cPLA2、PTGES3、SQS、UGT5A4、GSH-Px和PTGS等。表達下調(diào)的基因主要有：MICAL3A、LIPC、LPL、BDH1、ETTNPL、UGT1A7、SOAT2、UGT1A7和CPT-1等。

表3 不同劑量MC-LR暴露下草魚肝臟共同的脂質(zhì)代謝差異表達基因Tab.3 The common DEGs of lipid metabolism from grass carp liver exposure to different doses of MC-LR

2.3 不同劑量MC-LR對草魚肝臟PPAR信號通路和基因的影響

3 個劑量的MC-LR 對草魚肝臟PPAR 信號通路均有影響，其中25μg/kg 實驗組草魚肝臟PPAR 信號通路涉及12 個基因有顯著變化，其中表達顯著上調(diào)的基因主要包括FABP1和FABP4，表達顯著下調(diào)的基因主要包括FATP、PPARα、CYP7A1、LPL、ADIPO。而75 μg/kg 實驗組中草魚肝臟共有70 個基因有顯著差異表達，表達顯著上調(diào)的基因主要包括FABP1、FABP4、ILK和AQP7等9 個基因，表達顯著下調(diào)的基因包括FATP、PPARα、SCD-1、CYP7A1、CYP8B1、CYP27、FATP1、LPL、CYP4A1、CPT-1和CPT-2等61 個基因。100 μg MC-LR/kg 實驗組中草魚肝臟則有31 個基因表達有顯著變化，其中有FABP1、PGAR、FABP4、CAP和UBC6 個基因表達顯著上調(diào)，F(xiàn)ATP、PPARα、RXR、SCD-1、LPL、CYP7A1、CYP8B1、CYP27、CPT-1、CPT-2、LCAD和ACO等25個基因表達顯著下降。3個劑量的MC-LR對草魚肝臟PPAR信號通路上誘導的共同的DEGs 有8 個（表4），包括3 個上調(diào)的和5 個下調(diào)的表達基因，其中FABP4顯著上調(diào)，在25、75 和100μg/kg 實驗組的表達分別上調(diào)了3.39、41.07 和25.46 倍；FABP1分別上調(diào)了4.56、2.45 和2.19倍；PPARα在3個劑量組中分別下調(diào)了0.32、0.15和0.24倍，CYP7A1分別下調(diào)了0.47、0.18和0.35倍，LPL分別下調(diào)了0.42、0.27和0.46倍；其他3個表達有顯著變化的為未知基因。

表4 不同劑量MC-LR暴露下草魚肝臟PPAR信號通路上共同的差異表達基因Tab.4 The common DEGs of PPAR pathway from grass carp liver exposure to different dose of MC-LR

2.4 熒光定量PCR驗證結(jié)果

為驗證測序數(shù)據(jù)的準確性，隨機選取的3個DEGs進行qRT-PCR 反應(yīng)。結(jié)果顯示這3個基因表達水平的趨勢變化與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中的表達趨勢基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可信。

圖1 3個DEGs的熒光定量PCR及轉(zhuǎn)錄組的比較分析Fig.1 Comparison of three DEGs by quantitative real-time PCR and transcriptome analysis

3 討論

3.1 MC-LR對草魚肝臟脂質(zhì)代謝通路和差異表達基因的影響

肝臟是一個高度活躍的代謝器官，在全身脂質(zhì)代謝的各個方面起著關(guān)鍵作用[7]。目前，已有一些研究表明MCs 對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝有影響，并從基因表達水平、酶活水平、組織病理切片等方面進行了研究。如MC-LR 可導致小鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（Angpt1和PPAR）在mRNA 和蛋白水平均發(fā)生改變，增加腹腔脂肪質(zhì)量和體脂比，降低空腹血糖、血清中高密度脂蛋白以及甘油三酯含量[8]。韋宏曠等[9]通過檢測分析MC-LR 對小鼠MDA 的影響，發(fā)現(xiàn)MC-LR 會對肝臟脂質(zhì)代謝有影響。另外，MC-LR 也可通過改變血清中甘油三酯、不飽和脂肪酸和極低密度脂蛋白等代謝物的水平，從而造成小鼠肝脂質(zhì)代謝紊亂，引起肝臟質(zhì)量和腹部脂肪質(zhì)量增加[5]。以上報道均表明MC-LR可影響哺乳動物的脂質(zhì)代謝。

脂質(zhì)是生物體內(nèi)重要的一大類化合物，可分為脂肪酸、鞘脂類、糖脂和多聚酮類等八大類。這些脂質(zhì)在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是由復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)和反饋機制控制的，涉及機體的多個組織器官、轉(zhuǎn)錄因子、酶、激素和營養(yǎng)物質(zhì)等，不同的信號通路之間存在復(fù)雜的交互作用[10-11]。脂質(zhì)代謝受多個信號通路共同調(diào)控，包括脂肪酸合成代謝、不飽和脂肪酸合成通路、脂肪酸延長通路、脂肪酸降解通路、甘油磷脂代謝通路、甘油酯代謝通路、甾類激素生物合成通路、鞘脂類代謝通路、花生四烯酸代謝通路、醚脂類代謝通路等多個通路。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低劑量組（25μg/kg 組）的草魚肝臟中有12 條通路受到影響，而75μg/kg和100μg/kg實驗組受到影響的通路均有15條。在低劑量組中，脂肪酸合成通路、不飽和脂肪酸合成通路以及脂肪酸延長通路沒有受到影響，這說明MC-LR 對草魚肝臟脂質(zhì)代謝通路的影響存在一定的劑量差異。低劑量MC-LR 對草魚肝臟脂質(zhì)代謝影響較小，而高劑量對草魚肝臟脂質(zhì)代謝影響非常大，尤其是對脂肪酸降解信號通路有顯著影響，這與其他人報道不太一致。李智等[12]經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦注射MC-LR后，主要引起鞘脂類代謝障礙，而譚智蓉等[13]通過轉(zhuǎn)錄組測序同樣發(fā)現(xiàn)MC-LR主要對歐洲鰻鱺肝臟鞘脂類代謝有影響。盡管在筆者的研究中發(fā)現(xiàn)3個劑量組均可以導致鞘脂類代謝通路發(fā)生變化，但相對于其他通路來說，鞘脂類代謝通路在25，75，100μg/kg 實驗組中受到影響的脂質(zhì)代謝通路中均位列較后，這說明MC-LR 對草魚肝臟的影響并不是以鞘脂類代謝為主。除此之外，甘油磷脂代謝通路也有受到影響，這與在斑馬魚中的報道相似[14]?；ㄉ南┧?、亞油酸和α-linoleic酸在魚體中也都起著非常重要的作用[15]，本研究也發(fā)現(xiàn)了MC-LR可以引起這些通路的變化，必需的和重要的脂肪酸代謝通路中的任何干擾都可能影響大量的細胞和生物過程，這或許可以解釋MC-LR 可引起機體多方面毒性。以上研究說明這些代謝途徑并不是獨立工作的，而是相互聯(lián)系的，因此MC-LR對草魚脂質(zhì)代謝的影響也是非常復(fù)雜多樣的。

機體內(nèi)脂質(zhì)代謝與眾多脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達密不可分。本研究的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示25，75，100μg/kg 3個劑量組中的差異表達的脂質(zhì)相關(guān)基因分別有37、363和132個，其中3個劑量組中共同差異表達的差異基因為27個。這也說明MC-LR對草魚肝臟的脂質(zhì)代謝存在明顯影響。除了脂質(zhì)運輸外，肝臟中脂質(zhì)含量也依賴于脂肪酸β-氧化及膽固醇代謝和運輸[16]。其中，肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)在長鏈脂肪酸的β-氧化過程中十分關(guān)鍵[17]。Peroxisomal acyl-CoA oxidase 1（acox1），acyl-CoA dehydrogenase（acadm）和線粒體膜carnitine-dependent enzyme shuttle（cpt1a，cpt2）是脂肪酸β-oxidation 的關(guān)鍵酶[18]。CPT-1 是肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的第一個成分和限速步驟[19]，轉(zhuǎn)錄組測序和熒光定量的結(jié)果均顯示CPT-1在3個劑量組中的表達下降，說明MC-LR可降低長鏈脂肪酸的β-氧化，從而造成脂肪的沉積。另外，在本研究中，前列腺素的合成相關(guān)的基因PTGS2和PTGES3顯著上調(diào)，這可能與必須脂肪酸的合成被干擾相關(guān)，這些脂肪酸是合成前列腺素的前體分子[14]。肝臟脂肪生成與脂肪分解的不平衡是引起脂肪代謝異常的重要原因之一[20]，而肝臟脂質(zhì)代謝異常也是誘發(fā)肝癌的機制之一[21]，因此，MC-LR 易導致肝癌的發(fā)生的機制可能與脂質(zhì)代謝也有關(guān)。

3.2 MC-LR對草魚肝臟PPAR信號通路和差異表達基因的影響

PPAR 信號通路可以調(diào)控一系列與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因和通路[22]，這一通路在細胞內(nèi)脂肪酸代謝和脂質(zhì)儲存中起著重要作用[23]。不飽和脂肪酸的生物合成是PPAR 信號通路調(diào)控的下游途徑之一[24]，在不飽和脂肪酸生物合成的過程中，長鏈脂酰輔酶A 在Acaa1a 和Scd1 作用下通過脫乙酰、去飽和和延長轉(zhuǎn)化為多種未飽和脂肪酸，從而導致不飽和脂肪酸水平增加[25]。類固醇生物合成途徑也受到PPAR 信號通路激活的干擾，從而導致與膽汁酸代謝相關(guān)的膽固醇、膽堿和牛磺酸水平降低[26-27]。膽汁酸是一類膽固醇類內(nèi)分泌信號分子，在機體膽固醇吸收、代謝及調(diào)節(jié)中起著重要作用[28]。同時，膽汁酸可促進脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化[29]，其合成過程中出現(xiàn)的任何損傷都會引起整個脂質(zhì)代謝過程的紊亂[30]。

PPAR 信號通路可參與機體不同生理條件下的大量生化過程，其中包括炎癥、癌癥等多種復(fù)雜疾病的病理生理過程[5,31]。在本研究中，3個劑量組的差異表達基因均可富集到PPAR信號通路上。PPARα作為轉(zhuǎn)錄因子，它在肝臟脂質(zhì)代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用[32-33]，PPARα 也被認為是眾多調(diào)控脂分解代謝中最為關(guān)鍵的調(diào)控因子[34]，其可誘導脂肪酶分解基因的表達從而在脂肪酸的分解代謝方面起著重要的作用[35]。激活PPARα 可促進脂肪酸的吸收、利用以及脂肪酸的分解代謝[33]。筆者目前的研究顯示PPARα在3 個劑量組中的表達均顯著下降，PPARα 信號通路的其他下游基因如CYP7A1、LPL等表達也明顯下調(diào)，這些結(jié)果說明MC-LR 可降低草魚肝臟分解脂肪的能力從而影響脂質(zhì)代謝，可能會加速脂肪的沉積。FABPs 屬于細胞內(nèi)蛋白家族，它可以可逆地與疏水性配體結(jié)合，包括飽和及不飽和脂肪酸等，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[36]。本研究發(fā)現(xiàn)FABP1和FABP4在3 個劑量組中都表達增加，尤其是FABP4表達最高上調(diào)了41.07倍。FABP4作為細胞內(nèi)脂質(zhì)伴侶，可影響吸收、運輸、酯化和脂肪酸的β-氧化，調(diào)節(jié)能量平衡和細胞內(nèi)脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導[37]，本研究中3個劑量組的FABP4均表達上調(diào)，這進一步表明MC-LR 可能引起草魚肝臟代謝性障礙。

4 結(jié)論

本研究通過挖掘轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MC-LR 可干擾草魚肝臟脂質(zhì)代謝，且對草魚肝臟脂質(zhì)代謝的影響是一個復(fù)雜的生物過程，脂質(zhì)代謝差異表達基因主要富集在脂肪酸降解和PPAR 信號通路上，這些差異表達基因可嘗試開發(fā)為鑒定MC-LR干擾魚類脂質(zhì)代謝的分子標記。