李育敏，付曉歌，郭東月，龔海娜，曾子朗，姚潔儀，鄧巧梅，李雙，張秀明

(深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 & 深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518001)

新型冠狀病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)疫情在世界范圍內(nèi)持續(xù)流行，引發(fā)疫情的新型冠狀病毒(新冠病毒，2019-nCoV)基因組不斷變異，影響病毒的生物學(xué)特性。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第九版)，新冠病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性為確診的首要標(biāo)準(zhǔn)[1]。各醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)核酸檢測(cè)的質(zhì)量控制，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。按照《新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)(試行第二版)》要求[2]，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開展室內(nèi)質(zhì)控，每批檢測(cè)至少有1份弱陽(yáng)性質(zhì)控品(第三方質(zhì)控品，通常為檢出限的1.5～3倍)、3份陰性質(zhì)控品(生理鹽水)，質(zhì)控品隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中，參與從提取到擴(kuò)增的全過程。在新冠病毒核酸檢測(cè)過程中，第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控一旦出現(xiàn)失控，將會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。目前針對(duì)核酸檢測(cè)失控現(xiàn)象分析的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照國(guó)家文件規(guī)定每批檢測(cè)至少1份弱陽(yáng)性質(zhì)控(廣州邦德盛公司)，現(xiàn)就實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)的弱陽(yáng)性質(zhì)控失控案例進(jìn)行總結(jié)分析，探討相關(guān)影響因素和解決措施，供臨床參考。

1 案例分析

1.1室內(nèi)質(zhì)控失控案例1 當(dāng)天發(fā)現(xiàn)多批次弱陽(yáng)性質(zhì)控ORF1ab基因無(wú)Ct值或Ct值增高現(xiàn)象(圖1A)。針對(duì)失控可能發(fā)生的原因，實(shí)驗(yàn)室逐一排查。(1)核酸提取或擴(kuò)增：實(shí)驗(yàn)室采用的核酸提取試劑為重慶中元匯吉核酸提取試劑盒(磁珠法)，擴(kuò)增試劑為上海伯杰公司新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)。當(dāng)天失控批次的所有樣本檢測(cè)內(nèi)標(biāo)正常，表明核酸提取和擴(kuò)增過程正常。(2)質(zhì)控品：更換另一廠家擴(kuò)增試劑檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控，結(jié)果符合預(yù)期值(圖1B)，排除質(zhì)控品質(zhì)量問題。(3)試劑：當(dāng)天部分批次同時(shí)檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控和試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照，ORF1ab均無(wú)Ct值或Ct值增高(圖1C)，而另外部分批次試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照ORF1ab和N的Ct值雖然接近預(yù)期值，但其熒光強(qiáng)度(Rn)仍低于前一天未失控批次自帶的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)合第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控和自帶陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)失控的現(xiàn)象，考慮為檢測(cè)試劑出問題的可能性大，更換同一廠家新批號(hào)試劑后，檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控Ct值符合預(yù)期值(圖1D)，表明失控為試劑質(zhì)量問題所致。進(jìn)一步調(diào)查也證實(shí)失控是發(fā)生在當(dāng)天更換新批號(hào)試劑后，更換前檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)控均符合預(yù)期值。廠商反饋為提高檢測(cè)靈敏度，對(duì)該批號(hào)試劑進(jìn)行了優(yōu)化(具體環(huán)節(jié)不詳)，考慮可能為優(yōu)化后反應(yīng)體系如ORF1ab熒光探針等發(fā)生變化或其他干擾因素所致。

1.2室內(nèi)質(zhì)控失控案例2 連續(xù)2天多批次弱陽(yáng)性質(zhì)控ORF1ab的Ct值出現(xiàn)增高現(xiàn)象(圖2A)，質(zhì)控品均為同一批號(hào)，失控批次的樣本內(nèi)標(biāo)檢測(cè)正常，試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照ORF1ab和N的Ct值及Rn均正常(圖2B)，考慮為該批號(hào)質(zhì)控品出問題的可能性大。更換新批號(hào)質(zhì)控品后ORF1ab Ct值檢測(cè)正常(圖2C)，表明失控為該批號(hào)的質(zhì)控品自身質(zhì)量問題所致。

1.3室內(nèi)質(zhì)控失控案例3 當(dāng)天下午連續(xù)幾批弱陽(yáng)性質(zhì)控ORF1ab的Ct值出現(xiàn)明顯增高現(xiàn)象(圖3A-B)，質(zhì)控品批號(hào)和擴(kuò)增試劑批號(hào)均與前一天和當(dāng)天上午相同，重新提取該批號(hào)質(zhì)控品后檢測(cè)ORF1ab的Ct值仍增高，更換新批號(hào)質(zhì)控品，用同一種擴(kuò)增試劑同時(shí)檢測(cè)新、舊批號(hào)質(zhì)控，新批號(hào)質(zhì)控ORF1ab的Ct值明顯低于舊批號(hào)(圖3C)，表明為舊批號(hào)質(zhì)控品問題所致，但是同一舊批號(hào)質(zhì)控品前后結(jié)果出現(xiàn)明顯差異，考慮可能為質(zhì)控品反復(fù)凍融或儲(chǔ)存不當(dāng)發(fā)生了降解。繼續(xù)查看前后2天的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)天上午檢測(cè)試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照Ct值雖接近預(yù)期值，但熒光強(qiáng)度較前一天偏低，而且更換新批號(hào)質(zhì)控品后，ORF1ab Ct值雖明顯低于舊批號(hào)，但仍高于前一天，且熒光強(qiáng)度也較前一天弱，表明擴(kuò)增試劑也存在問題。質(zhì)控品和試劑兩者均出現(xiàn)問題，因此考慮存儲(chǔ)不當(dāng)?shù)目赡苄源?，而?shí)驗(yàn)室未發(fā)生斷電現(xiàn)象，考慮為冰箱門未封閉嚴(yán)密導(dǎo)致的溫度不達(dá)標(biāo)。將擴(kuò)增試劑和質(zhì)控品均更換后，檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控結(jié)果Ct值恢復(fù)至前一天預(yù)期值水平。采用新更換的試劑同時(shí)檢測(cè)新、舊質(zhì)控品，舊質(zhì)控較新質(zhì)控的ORF1ab Ct值更高，表明除儲(chǔ)存原因外，舊質(zhì)控品還存在多次使用、反復(fù)凍融的問題。

注：黃色，內(nèi)標(biāo)；綠色，N基因；藍(lán)色，ORF1ab基因。圖1 室內(nèi)質(zhì)控失控案例1

注：黃色，內(nèi)標(biāo)；綠色，N基因；藍(lán)色，ORF1ab基因。圖2 室內(nèi)質(zhì)控失控案例2

注：黃色，內(nèi)標(biāo)；綠色，N基因；藍(lán)色，ORF1ab基因。圖3 室內(nèi)質(zhì)控失控案例3

1.4室內(nèi)質(zhì)控失控案例4 將中值質(zhì)控品(參考濃度：1.6×104copies/mL)稀釋20倍至800 copies/mL作為弱陽(yáng)性質(zhì)控(檢出限500 copies/mL)，稀釋初期檢測(cè)結(jié)果符合預(yù)期值，但是后續(xù)逐漸出現(xiàn)部分批次弱陽(yáng)性質(zhì)控ORF1ab Ct值增高現(xiàn)象，檢測(cè)批次的Ct值強(qiáng)弱不等，重復(fù)性較差。而檢測(cè)質(zhì)控品原液(未稀釋)的Ct值符合預(yù)期值，且重復(fù)性較好，表明稀釋對(duì)質(zhì)控品的保存有一定影響，稀釋后質(zhì)控品存在降解和不穩(wěn)定現(xiàn)象。

2 討論

按照《新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)(試行第二版)》要求[2]，實(shí)驗(yàn)室開展室內(nèi)質(zhì)控，弱陽(yáng)性質(zhì)控需采用第三方質(zhì)控品。目前，廠商制備的新冠病毒核酸檢測(cè)第三方質(zhì)控品以假病毒為原料，使用較為廣泛的有廣州邦德盛、北京康徹思坦等生物技術(shù)公司生產(chǎn)的室內(nèi)質(zhì)控品。相比試劑盒自帶的強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照，采用第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控品的優(yōu)勢(shì)在于不針對(duì)于特定檢測(cè)系統(tǒng)和試劑進(jìn)行優(yōu)化，具有廣泛的通用性，可更為客觀地評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)和反映誤差水平，更好地監(jiān)控不同廠家的試劑檢測(cè)弱陽(yáng)性樣本的靈敏度，避免病毒拷貝數(shù)較低時(shí)，因檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度低導(dǎo)致弱陽(yáng)性樣本漏檢，出現(xiàn)假陰性；其次陽(yáng)性質(zhì)控的濃度越低，核酸污染的風(fēng)險(xiǎn)越小。3份陰性質(zhì)控品參與從提取到擴(kuò)增的步驟，可有效監(jiān)測(cè)核酸檢測(cè)的全流程是否存在污染，也可以將其中1份生理鹽水暴露在生物安全柜內(nèi)，直接加入到檢測(cè)試劑中監(jiān)測(cè)生物安全柜是否存在氣溶膠污染。3份陰性質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果均為陰性，弱陽(yáng)性質(zhì)控為陽(yáng)性，且Ct值符合預(yù)期值，視為室內(nèi)質(zhì)控在控，否則為失控。

核酸提取及擴(kuò)增過程、試劑和質(zhì)控品質(zhì)量等出現(xiàn)問題均可引起失控。一般情況下，如樣本內(nèi)標(biāo)檢測(cè)正常，核酸提取和擴(kuò)增步驟出問題的可能性較小，那么發(fā)生失控首先考慮試劑或質(zhì)控品的問題。本研究分析的失控案例1和案例2分別由試劑和質(zhì)控品問題所致，而失控案例3分析原因后考慮為儲(chǔ)存不當(dāng)所致的試劑和質(zhì)控品均出現(xiàn)問題，將擴(kuò)增試劑和質(zhì)控品均更換后，檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控結(jié)果正常。因此，建議每批次同時(shí)檢測(cè)2份弱陽(yáng)性對(duì)照，1份為第三方質(zhì)控品，1份為試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照稀釋至檢出限的1.5～3倍(Ct值與第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控品接近)，以便發(fā)生失控時(shí)能夠及時(shí)查找原因，采取糾正措施。另外檢測(cè)試劑配制好后應(yīng)避光保存，并盡快使用，更換新批號(hào)試劑后，應(yīng)按文件規(guī)定驗(yàn)證試劑批間差異和關(guān)鍵耗材抑制物[3]。

除以上原因外，質(zhì)控品的正確保存也是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素之一。本研究分析的失控案例3由于儲(chǔ)存原因所致保存溫度不達(dá)標(biāo)，案例4由于將質(zhì)控品原液稀釋后影響了保存穩(wěn)定性。邦德盛液體質(zhì)控品首先對(duì)新冠假病毒(含ORF1ab、N、E和M基因)進(jìn)行構(gòu)建和培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液，對(duì)收獲的假病毒培養(yǎng)液進(jìn)行初步定值，然后用陰性稀釋液稀釋至所需濃度，并添加了適量的穩(wěn)定劑。如實(shí)驗(yàn)室因檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控的濃度要求，進(jìn)行再次稀釋時(shí)采用的稀釋液或稀釋后儲(chǔ)存的耗材含RNase或抑制物等都可能影響質(zhì)控品的穩(wěn)定性，因此建議直接使用適合參考濃度(檢出限的1.5～3倍)的質(zhì)控品原液進(jìn)行檢測(cè)，如邦德盛液體質(zhì)控品低值(參考濃度：1.4×103copies/mL)，避免因稀釋造成的質(zhì)控不穩(wěn)定現(xiàn)象。另外質(zhì)控品原液及其提取后的核酸應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行保存和使用，不可反復(fù)凍融或長(zhǎng)時(shí)間存放于室溫及2～4 ℃，避免質(zhì)控品降解或變質(zhì)。

在臨床新冠病毒核酸檢測(cè)過程中經(jīng)常會(huì)觀察到N基因和ORFlab基因的檢出率存在差異，N基因的陽(yáng)性率通常高于ORF1ab基因，檢出的Ct值大于ORF1ab基因，這可能跟以下因素有關(guān)[4-10]：(1)ORF1ab基因特異性強(qiáng)，而N基因相對(duì)保守，易與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)；(2)新冠病毒轉(zhuǎn)錄新的mRNA均帶有N基因，而ORF1ab基因拷貝數(shù)較低；(3)2個(gè)基因序列不同，不同廠家的試劑設(shè)計(jì)對(duì)ORF1ab基因和N基因的檢測(cè)靈敏度存在差異等。同樣第三方弱陽(yáng)性質(zhì)控品失控也常首先觀察到ORF1ab基因Ct值增高或檢測(cè)不出，而N基因可檢出。由于第三方質(zhì)控品非臨床樣本，其原因主要與試劑的靈敏度有關(guān)。

綜上所述，新冠病毒核酸檢測(cè)出現(xiàn)弱陽(yáng)性質(zhì)控失控，要從核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)結(jié)果全流程進(jìn)行追溯分析，并結(jié)合試劑和質(zhì)控品綜合判斷失控原因及影響因素，及時(shí)采取相應(yīng)的糾正措施，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。