劉玉鑫,韓迎香,包愛玲,王雅菲,袁向珍,托婭

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.體檢中心，呼和浩特 010050)

細(xì)菌性血流感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是血培養(yǎng)，但由于培養(yǎng)周期長、結(jié)果陽性率低等原因，不利于急性感染的診斷和治療。目前感染相關(guān)的常規(guī)檢測指標(biāo)包括外周血白細(xì)胞計數(shù)(white blood cell count，WBC)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、紅細(xì)胞沉降率和降鈣素原(procalcitonin，PCT)等，但對細(xì)菌感染診斷普遍沒有較好的敏感性和特異性。Th1/Th2是輔助性T淋巴細(xì)胞亞群，分泌的多種細(xì)胞因子發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，促使機(jī)體免疫環(huán)境維持在健康的平衡狀態(tài)。近年來，逐漸關(guān)注其在評估機(jī)體感染嚴(yán)重程度方面的潛在價值。本研究主要基于流式微球陣列技術(shù)(cytometric bead array，CBA)檢測感染狀態(tài)下Th1/Th2細(xì)胞因子譜的變化，探討革蘭陽性/革蘭陰性(G+/G-)血流感染的類型與不同實(shí)驗(yàn)室生物標(biāo)志物的關(guān)系，旨在為臨床診斷和治療血流感染提供有利的參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 納入2019年9月—2021年8月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院患者中細(xì)菌性血流感染89例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18周歲；(2)細(xì)菌血培養(yǎng)陽性患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血培養(yǎng)樣本受污染；(2)真菌、病毒、支原體感染；(3)合并免疫系統(tǒng)疾??；(4)研究資料不完整。根據(jù)感染類型，分為G+菌感染組46例、G-菌感染組43例。G+菌感染組男性33例，女性13例，年齡(59.07±13.53)歲;G-菌感染組男性21例，女性22例，年齡(63.09±12.92)歲。另擇同期體檢健康者31例納入健康人對照組，男性21例，女性10例，年齡(58.26±15.65)歲。各組性別和年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：WZ2022049)。

1.2儀器與試劑 FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，人Th1/Th2亞群檢測試劑盒(江西賽基公司)；mindray CAL-8000全自動血細(xì)胞分析儀和配套檢測試劑(深圳邁瑞公司)；Aristo軌道式全自動特定蛋白分析儀和配套CRP檢測試劑(深圳國賽公司)；UniCel Dxl 800全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，PCT檢測試劑盒(四川沃文特公司)。

1.3Th1/Th2細(xì)胞因子譜測定 基于流式CBA技術(shù)，測定血清樣本的細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量，檢測上、下限分別為2.5 pg/mL和2 500 pg/mL，參考區(qū)間上限分別為5.71、2.80、5.30、4.91、2.31和7.42 pg/mL。

1.4WBC測定 按試劑說明書操作。WBC參考區(qū)間為3.5×109/L～9.5×109/L。

1.5CRP測定 基于免疫散射比濁法，按試劑說明書操作。參考區(qū)間為0～5 mg/L。

1.6PCT測定 基于磁微粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)，按夾心法原理進(jìn)行免疫檢測，按試劑說明書操作，通過濃度—相對發(fā)光值的校準(zhǔn)曲線，計算PCT濃度。檢測下限為0.02 μg/L，參考區(qū)間上限為0.05 μg/L。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌性血流感染患者病原菌種類分布 血培養(yǎng)共檢出病原菌89株，其中G+菌占51.69%，G-菌占48.31%。G+細(xì)菌主要為鏈球菌9株(10.11%)、人葡萄球菌人亞種9株(10.11%)、金黃色葡萄球菌8株(8.99%)和表皮葡萄球菌6株(6.74%)；G-細(xì)菌主要為大腸埃希菌20株(22.47%)和肺炎克雷伯菌5株(5.62%)。

2.2各組Th1/Th2細(xì)胞因子譜、WBC、CRP、PCT水平比較 各感染評價指標(biāo)在G+菌感染組、G-菌感染組和健康人對照組間水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，見表1。組間比較發(fā)現(xiàn)，各感染組指標(biāo)水平均顯著高于健康人對照組。其中，G-菌感染組IL-6、IL-10和PCT水平與G+菌感染組比較，差異有統(tǒng)計意義(U=628.00，P<0.01；U=107.00，P<0.01；U=683.00，P<0.05)。

表1 各組Th1/Th2細(xì)胞因子譜、WBC、CRP和PCT水平比較[M(P25，P75)]

2.3Th1/Th2細(xì)胞因子譜與各感染指標(biāo)相關(guān)性 對Th1/Th2細(xì)胞因子譜與臨床常見的3種感染指標(biāo)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果表明，細(xì)菌血流感染組和G-菌感染組的IL-6和IL-10表達(dá)水平與PCT水平表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，而G+菌感染組僅IL-10表達(dá)水平與PCT呈較強(qiáng)相關(guān)性，IL-6水平與PCT表現(xiàn)中等程度相關(guān)。此外，細(xì)菌血流感染組和G+菌感染組IL-6表達(dá)水平與CRP水平分別表現(xiàn)中等和較強(qiáng)相關(guān)性，而IL-10與CRP水平呈弱相關(guān)。在G-菌感染組中，僅TNF-α表達(dá)與PCT水平呈較弱的相關(guān)性。細(xì)菌血流感染組和G+菌感染組的IFN-γ表達(dá)水平與WBC和PCT水平表現(xiàn)為弱的負(fù)相關(guān)。其余細(xì)胞因子如IL-2和IL-4，與WBC、CRP和PCT水平并無相關(guān)性(P均>0.05)。見表2。

2.4Th1/Th2細(xì)胞因子譜、PCT和CRP診斷細(xì)菌性血流感染價值分析 按血培養(yǎng)結(jié)果，不同組別間以敏感性為縱坐標(biāo)，1-特異性為橫坐標(biāo)，繪制ROC曲線。細(xì)胞因子譜在評估患者是否存在細(xì)菌性血流感染(圖1A)、區(qū)分G+細(xì)菌性血流感染和非感染(圖1B)、G-細(xì)菌性血流感染和非感染(圖1C)方面均表現(xiàn)出中等到高水平的診斷價值(P均<0.05)。細(xì)胞因子譜、PCT和CRP在鑒別G+/G-細(xì)菌性血流感染方面，IL-6、IL-10、PCT和CRP曲線下面積分別為0.683、0.702、0.655和0.602(圖1D；表3)，對比4種感染指標(biāo)的診斷效能，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。4種指標(biāo)聯(lián)合其他因子在該研究中未顯示對G+/G-細(xì)菌性血流感染的區(qū)分能力(P均>0.05)。

表2 Th1/Th2細(xì)胞因子譜對各感染指標(biāo)的相關(guān)性(r)分析

注：A，區(qū)分細(xì)菌性感染與非感染；B，區(qū)分G+細(xì)菌性感染和非感染；C，區(qū)分G-細(xì)菌性感染和非感染；D，區(qū)分G+細(xì)菌性感染和G-細(xì)菌性感染。圖1 Th1/Th2細(xì)胞因子譜、CRP和PCT評估細(xì)菌性血流感染的ROC曲線

表3 Th1/Th2細(xì)胞因子譜、PCT和CRP在鑒別G+/G-細(xì)菌性血流感染方面的參數(shù)

3 討論

細(xì)菌性血流感染因其復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制極易引起機(jī)體不同程度的感染，甚至全身性中毒反應(yīng)，亟需更高效、更有價值的感染標(biāo)志物以輔助診斷血流感染和指導(dǎo)用藥。流式CBA技術(shù)是以流式細(xì)胞儀為檢測平臺的液相多重蛋白質(zhì)定量技術(shù)，以不同大小或攜帶不同熒光信號的微球?yàn)檩d體，能同時定量測量樣品中的多種可溶性分子和細(xì)胞因子，具有高通量、線性范圍廣、準(zhǔn)確性高和重復(fù)性好等諸多優(yōu)勢[1]。流式CBA的應(yīng)用，突破了傳統(tǒng)ELISA檢測細(xì)胞因子費(fèi)時費(fèi)力，尤其不適用于緊急感染患者等方法學(xué)限制，使細(xì)胞因子譜的臨床應(yīng)用價值研究進(jìn)一步擴(kuò)大，Th1/Th2細(xì)胞因子譜評估感染研究也愈加深入。

機(jī)體感染病原入血后，激活免疫反應(yīng)釋放的多種細(xì)胞因子在感染和抗感染過程中相互作用而發(fā)揮重要功能，不同類型的病原體由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和抗原成分而釋放不同的細(xì)胞因子類型和含量[2-3]。如超抗原是金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌為代表的G+菌誘導(dǎo)的有效毒素之一，可不進(jìn)行抗原提呈，直接觸發(fā)Th1細(xì)胞增殖釋放大量促炎因子IL-2、TNF-α和IFN-γ[4]，而內(nèi)毒素或脂多糖為G-菌的有效毒力因子，會持續(xù)活化巨噬細(xì)胞使其釋放過量促炎因子，放大炎癥反應(yīng)，引起內(nèi)毒素休克。同時機(jī)體誘導(dǎo)抗炎因子以調(diào)控免疫失衡，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-1ra、IL-10等多因子明顯升高，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫麻痹[3,5]。本研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2細(xì)胞因子譜在機(jī)體血流感染后均表現(xiàn)出顯著增高，但不同因子增高水平在不同組別中存在差異。其中，IL-6和IL-10在G-菌感染后表達(dá)上調(diào)最為顯著，較G+菌感染組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與國內(nèi)外病原感染的相關(guān)研究結(jié)果一致[6-9]。這一結(jié)論有利于感染早期鑒別病原菌類別，有效防止抗菌藥物濫用，并且多項研究均表明IL-6和IL-10濃度與血流感染的嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)[6,10-11]。而TNF-α和IFN-γ在本研究中未發(fā)現(xiàn)有除識別感染狀態(tài)外其他的作用。但有文獻(xiàn)指出，血清TNF-α水平和動態(tài)變化嚴(yán)重影響敗血癥預(yù)后，G-菌敗血癥水平顯著高于G+菌敗血癥，而前者往往更易發(fā)生感染性休克、多器官功能衰竭等高死亡率事件[12]。IFN-γ可與TNF-α發(fā)生協(xié)同作用，在細(xì)胞毒性反應(yīng)和G-菌敗血癥中促進(jìn)細(xì)胞膜TNF-α的表達(dá)[13]。IL-2和IL-4在不同類型細(xì)菌血流感染中變化無差別，且較其他細(xì)胞因子血清濃度水平增高幅度不顯著，這可能與這2種因子半衰期較短，僅5～19 min有關(guān)[14]。Th1/Th2細(xì)胞因子譜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，病原感染所涉及的機(jī)體免疫相關(guān)機(jī)制也存在爭議。同樣，比較血流感染時WBC、CRP和PCT等幾種傳統(tǒng)感染指標(biāo)的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)PCT水平在G+菌感染和G-菌感染中表現(xiàn)出差異，WBC和CRP在不同組別中并無特異性。

為深入研究Th1/Th2細(xì)胞因子譜與臨床常見的3種感染指標(biāo)的關(guān)系，進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。PCT與IL-6在G-菌感染時其相關(guān)程度大于G+菌感染，這與研究中G-菌感染時PCT水平增高更明顯是一致的。CRP與IL-6也表現(xiàn)出一定相關(guān)性。在炎癥早期，上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等均可分泌高水平的IL-6，并進(jìn)一步促進(jìn)肝臟合成并釋放PCT和CRP。IFN-γ與臨床常規(guī)感染指標(biāo)WBC和PCT呈弱的負(fù)相關(guān)，這可能由于嚴(yán)重病原感染菌血癥時，IFN-γ大量消耗或產(chǎn)生不足，又或二者共同作用所致[6,15]，其詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

繪制ROC曲線分析Th1/Th2細(xì)胞因子譜、CRP和PCT診斷細(xì)菌性血流感染價值，Th1/Th2細(xì)胞因子譜具有區(qū)分是否感染的明顯優(yōu)勢，IL-6和 IL-10在鑒別G+菌和G-菌感染中表現(xiàn)不同濃度水平的變化趨勢和診斷效能。ROC曲線證實(shí)IL-10對血流感染中G-菌感染有較好的診斷效果，IL-10>56.775 pg/mL，患者更有可能發(fā)生G-菌血流感染，并且敏感性可以達(dá)到89.10%。IL-6在這方面敏感性較差，但較高的特異性可作為感染的排除指標(biāo)，IL-6<57.260 pg/mL認(rèn)為更有可能排除G-菌感染導(dǎo)致的菌血癥。比較IL-6、IL-10、PCT和CRP的AUC，未發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-10的鑒別細(xì)菌感染類型的性能優(yōu)于后兩者，這與Xu等[16]在兒童腫瘤患者識別G-菌血癥和膿毒癥休克的研究中IL-6和IL-10鑒別效果優(yōu)于PCT和CRP的結(jié)論相異，差異可能是由于研究人群的差別和本研究標(biāo)本量較少所致。

綜上，Th1/Th2細(xì)胞因子譜作為細(xì)菌性血流感染新的標(biāo)志物具有其顯著優(yōu)勢，通過比較IL-6和IL-10表達(dá)水平，有助于提示臨床病原菌分類，為臨床病原診斷及用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本研究仍存在一些不足，一方面研究結(jié)果仍受到樣本數(shù)量的限制；另一方面未考慮感染指標(biāo)的采集時間相對于感染開始的不同動力學(xué)，研究數(shù)據(jù)來自臨床常規(guī)檢測報告，可能不是每種感染標(biāo)志物識別病原菌的最佳表現(xiàn)。