董珺 呂饒 高芳 于佳迪 李柳蓁 湛楚藍(lán)李月亮 劉慰華 黎佼

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州 510260）；2山東省濱州市人民醫(yī)院（山東濱州 256600）；3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院（廣東清遠(yuǎn) 511518）

衰老損害了細(xì)胞的功能，包括端粒長度縮短、端粒酶活性下降、線粒體活性下降、自噬功能下降等[1-4]。細(xì)胞的衰老，同樣影響了細(xì)胞移植治療效果[5-8]。心外膜細(xì)胞被證實(shí)，可以通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、旁分泌生長因子等途徑，改善心肌梗死后小鼠心臟功能[9-10]。本課題組前期研究證實(shí)，年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞，可通過旁分泌生長因子促進(jìn)心外膜細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。而衰老對心外膜細(xì)胞功能的影響，以及年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞對年老小鼠心外膜細(xì)胞衰老的調(diào)控作用鮮見報(bào)道。為此，2019年6月至2022年6月，本課題組研究了年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞對年老小鼠心外膜細(xì)胞衰老的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同年齡段小鼠選取選取C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物（月齡2～3個月作為年輕小鼠，月齡22～23個作為年老小鼠）。購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK（粵）2018?0002]。并通過倫理委員會審查（審查編號：廣醫(yī)二院B2021?021）。

1.1.2 主要試劑及儀器細(xì)胞分選試劑（Stem Cell Technology，Cat#：18756）；P16免疫熒光染色抗體（Abcam，Cat#：ab54210）；GDNF ELISA檢測試劑盒（Abcam，Cat#：ab171178）；Transwell室（Corning）；熒光定量PCR儀（ABI）。

1.2 方法

1.2.1 Sca?1細(xì)胞的提取及鑒定分別收集年輕和年老小鼠股骨中骨髓細(xì)胞，通過試劑盒分選Sca?1及Sca?1?細(xì)胞，并鑒定細(xì)胞比例[10-11]。年輕小鼠來源Sca?1細(xì)胞作為年輕組（Y Sca?1），年老小鼠來源Sca?1細(xì)胞作為年老組（O Sca?1）。

1.2.2 心外膜細(xì)胞培養(yǎng)收集年輕和年老小鼠心臟，0.25%胰酶消化20 min。離心后，收集心外膜細(xì)胞于DMEM中。培養(yǎng)1 h后，移除不貼壁細(xì)胞。3 d后換液，通過WT1染色鑒定細(xì)胞[11-12]。年輕小鼠來源心外膜細(xì)胞作為年輕組（Y），年老小鼠來源心外膜細(xì)胞作為年老組（O）。

1.2.3 細(xì)胞衰老檢測P16免疫熒光染色檢測細(xì)胞衰老。細(xì)胞（2×105/cm2）經(jīng)不同處理后，2%多聚甲醛固定細(xì)胞，P16一抗（1∶100）4℃染色過夜，二抗室溫染色2 h，熒光顯微鏡下檢測染色陽性細(xì)胞。

1.2.4 qRT?PCR檢測收取心外膜細(xì)胞總RNA，比較不同處理組中基因表達(dá)（P27、Sirt 1、Gdnf）?；蛞镆姳?。

表1 qRT?PCR引物序列Tab.1 The sequences of qRT?PCR primer

1.2.5 Western blot檢測收取心外膜細(xì)胞蛋白，比較不同處理組中蛋白表達(dá)（P27、Sirt 1）。

1.2.6 細(xì)胞共培養(yǎng)Sca?1細(xì)胞與年老心外膜細(xì)胞（O）通過Transwell小室共培養(yǎng)。無血清，低氧培養(yǎng)（0.1% O2）72 h后，檢測細(xì)胞衰老及相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)。

1.2.7 細(xì)胞旁分泌生長因子鑒定Y/O組Sca?1細(xì)胞，無血清，低氧培養(yǎng)（0.1% O2）72 h后，收集細(xì)胞及上清。通過qRT?PCR檢測細(xì)胞中Gdnf的表達(dá)。通過ELISA檢測試劑盒，檢測細(xì)胞及上清中GDNF的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 不同年齡組心外膜細(xì)胞的衰老表達(dá)對比收集Y及O心外膜細(xì)胞（圖1A）。發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下（0.1%O2），與Y組相比，O組衰老細(xì)胞（P16染色陽性）比例上升4倍（圖1B、表2）；衰老相關(guān)基因P27表達(dá)上升2.26倍（圖1C），抗衰老相關(guān)基因Sirt 1下降69%（圖1C、表2）；衰老相關(guān)蛋白P27表達(dá)上升2.07倍（圖1D），抗衰老相關(guān)蛋白Sirt 1下降79%（圖1D、表2，均P＜0.05）。

圖1 心外膜細(xì)胞隨年齡增加而衰老表達(dá)增加Fig.1 The senescence expression of epicardial cell was increased with ageing

表2 不同年齡組心外膜細(xì)胞衰老表達(dá)Tab.2 The senescence expression in different age epicardial cell ±s

表2 不同年齡組心外膜細(xì)胞衰老表達(dá)Tab.2 The senescence expression in different age epicardial cell ±s

項(xiàng)目P16熒光染色陽性細(xì)胞比例P27 mRNA Sirt 1 mRNA P27蛋白Sirt 1蛋白Y組17.100±2.451 1.000±0.076 1.000±0.064 1.000±0.102 1.000±0.062 O組68.400±8.577 2.265±0.163 0.331±0.126 2.067±0.603 0.310±0.027 P值＜0.001＜0.001 0.002 0.037＜0.001

2.2 年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞對年老心外膜細(xì)胞衰老表達(dá)的調(diào)控作用與O Sca?1細(xì)胞共培養(yǎng)組相比，Y Sca?1細(xì)胞共培養(yǎng)組，衰老細(xì)胞（P16染色陽性）比例下降64%（圖2A、表3）；衰老相關(guān)基因P27表達(dá)下降54%（圖2B），抗衰老相關(guān)基因Sirt 1上升2.1倍（圖2B、表3）；衰老相關(guān)蛋白P27表達(dá)下降57.9%（圖2C），抗衰老相關(guān)蛋白Sirt 1上升1.72倍（圖2C、表3，均P＜0.05）。

圖2 年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞可減少年老心外膜細(xì)胞衰老Fig.2 Young Sca1 bone marrow stem cell decreased old epicardial cell senescence

表3 年輕/年老Sca?1骨髓干細(xì)胞對年老心外膜細(xì)胞衰老的調(diào)控作用Tab.3 The effect of young and old Sca?1 bone marrow stem cell on old epicardial cell senescence ±s

表3 年輕/年老Sca?1骨髓干細(xì)胞對年老心外膜細(xì)胞衰老的調(diào)控作用Tab.3 The effect of young and old Sca?1 bone marrow stem cell on old epicardial cell senescence ±s

項(xiàng)目P16熒光染色陽性細(xì)胞比例P27 mRNA Sirt 1 mRNA P27蛋白Sirt 1蛋白O+O Sca1組66.400±3.460 1.000±0.061 1.000±0.072 1.000±0.116 1.000±0.107 O+Y Sca1組24.067±1.976 0.465±0.031 2.098±0.310 0.421±0.047 1.720±0.223 P值＜0.001＜0.001 0.003 0.001 0.008

2.3 年齡對Sca?1骨髓干細(xì)胞旁分泌生長因子的影響與O Sca?1細(xì)胞相比，Y Sca?1細(xì)胞中，Gdnf基因表達(dá)上升3.01倍，GDNF蛋白的表達(dá)上升2.74倍。與O Sca?1細(xì)胞上清相比，Y Sca?1細(xì)胞上清中GDNF的表達(dá)上升2.25倍（圖3、表4，均P＜0.05）。

表4 年齡對Sca?1骨髓干細(xì)胞旁分泌生長因子的影響Tab.4 The effect of ageing on Sca1 bone marrow stem cell paracrine function ±s

表4 年齡對Sca?1骨髓干細(xì)胞旁分泌生長因子的影響Tab.4 The effect of ageing on Sca1 bone marrow stem cell paracrine function ±s

項(xiàng)目Gdnf mRNA細(xì)胞 GDNF（pg/mg）細(xì)胞上清GDNF（pg/mg）O Sca1組1.000±0.141 567.857±34.693 118.357±11.840 Y Sca1組3.01±0.723 1 556.399±111.830 266.219±27.902 P值0.010＜0.001 0.001

圖3 年齡對Sca?1骨髓干細(xì)胞旁分泌生長因子的影響Fig.3 The effect of ageing on Sca1 bone marrow stem cell paracrine function

2.4 年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞減少年老心外膜細(xì)胞衰老的機(jī)制研究中和年輕Sca?1細(xì)胞旁分泌的GDNF（R&D，15 μg/mL）。與 Y Sca?1細(xì)胞共培養(yǎng)對照組相比，中和GDNF組，衰老細(xì)胞（P16染色陽性）比例上升4.79倍（圖4A、表5）；衰老相關(guān)基因P27表達(dá)上升2.05倍，抗衰老相關(guān)基因Sirt 1表達(dá)下降62%（圖4B、表5）。衰老相關(guān)蛋白P27表達(dá)上升1.9倍，抗衰老相關(guān)蛋白Sirt 1表達(dá)下降52%（圖4C、表5），均P＜0.05。

圖4 年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞通過旁分泌GDNF減少年老心外膜細(xì)胞衰老Fig.4 Young Sca1 bone marrow stem cell decreased old epicardial cell senescence through GDNF

表5 年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞減少年老心外膜細(xì)胞衰老的機(jī)制研究Tab.5 The molecular mechanisms study of young Sca1 bone marrow stem cell decreased old epicardial cell senescence x±s

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，Sca?1干細(xì)胞可調(diào)控心臟損傷修復(fù)[13-16]。在小鼠中敲除 Sca?1 基因，引起小鼠心肌收縮缺陷，并影響心臟祖細(xì)胞的增殖能力[17]。相反的，過表達(dá)Sca?1，可減少主動脈縮窄引起的小鼠心肌肥大和心臟纖維化，改善小鼠心臟功能[18]。心外膜細(xì)胞在心臟發(fā)育以及心臟損傷修復(fù)中的作用，在近年也得到進(jìn)一步的關(guān)注[19]。有研究發(fā)現(xiàn)年齡也影響了Sca?1干細(xì)胞的功能。對不同年齡段來源的Sca?1干細(xì)胞的對比研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的衰老隨年齡增加而表達(dá)增加，例如：端粒酶活性下降[20]。但是年齡對心外膜細(xì)胞功能的影響，以及不同年齡段來源的Sca?1干細(xì)胞對心外膜細(xì)胞的調(diào)控作用尚未明確。通過本研究證實(shí)隨年齡增加，小鼠心外膜細(xì)胞衰老表達(dá)增加。年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞可明顯減少年老小鼠心外膜細(xì)胞衰老。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）在前期研究中，被發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞再生中發(fā)揮調(diào)控作用[21-25]。例如在小鼠唾液腺干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，GDNF可促進(jìn)干細(xì)胞存活及增殖，緩解放射損傷[22]。本研究證實(shí)與O Sca?1細(xì)胞相比，Y Sca?1細(xì)胞可分泌更多的GDNF。年輕小鼠Sca?1骨髓干細(xì)胞可通過旁分泌GDNF減少年老心外膜細(xì)胞衰老。

本研究探討了年輕Sca?1骨髓干細(xì)胞對年老小鼠心臟細(xì)胞功能的調(diào)控作用及分子機(jī)制，為衰老相關(guān)疾病的細(xì)胞治療提供了更多的證據(jù)支持。