陳利全 黃燦雄 蘇以強(qiáng)

（惠來(lái)縣生態(tài)公益林管理中心，廣東 惠來(lái) 515200)

木麻黃Casuarina equisetifolia屬木麻黃科木麻黃屬植物，具有早期生長(zhǎng)迅速、材質(zhì)優(yōu)良、耐鹽抗旱能力強(qiáng)等特性[1-2]，因此被我國(guó)華南和東南沿海地區(qū)作為重要的生態(tài)防護(hù)和造林用材樹(shù)種，對(duì)防御海浪侵蝕、減少臺(tái)風(fēng)侵害起到不可替代的作用[3-5]。然而研究發(fā)現(xiàn)，木麻黃幼齡期鹽敏感性較強(qiáng)[6-8]，在鹽濃度較高的沿海灘涂地區(qū)種植時(shí)，早期鹽害現(xiàn)象較為明顯，育林成效普遍不高[9]。

鹽脅迫是自然界中最為常見(jiàn)的一種逆境脅迫，能導(dǎo)致植物產(chǎn)量、生理代謝及分子水平等系列復(fù)雜的變化，有關(guān)鹽對(duì)植物生理生化的影響以及植物耐鹽適應(yīng)機(jī)制一直被視為研究工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)[10-12]。鈣是植物生長(zhǎng)生理代謝活動(dòng)中的第二信使，是一種重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[13]。前人研究發(fā)現(xiàn)，外源鈣能有效緩解鹽脅迫對(duì)植物的傷害，但目前有關(guān)外源鈣對(duì)緩解木麻黃幼苗鹽害方面的報(bào)道尚鮮少見(jiàn)[14-18]。基于此，本試驗(yàn)以木麻黃幼苗為研究對(duì)象，探討鹽脅迫下外源鈣對(duì)木麻黃幼苗生長(zhǎng)生理方面的影響，旨在揭示外源鈣在緩解木麻黃鹽害方面的潛力及其作用機(jī)制，以期為今后沿海木麻黃的高效培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

種子采自廣東省惠來(lái)縣木麻黃防護(hù)林，晾曬后選取顆粒飽滿的種子經(jīng)催芽、萌發(fā)后，移至裝有基質(zhì)（泥炭土、珍珠巖、蛭石按等體積比混勻）的容器杯中，待苗木培育3 個(gè)月后，選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)較好、苗高10 cm 左右的苗木放在1/2 Hoagland 完全營(yíng)養(yǎng)液(Hoagland 和Arnon 1950)中進(jìn)行水培備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理 適應(yīng)性培養(yǎng)半個(gè)月后，參考前人方法進(jìn)行鹽脅迫和外源鈣交互作用處理[19-20]。其中，鹽脅迫處理設(shè)置0（S0）、40（S1）、80（S2）、120（S3）、160（S4）mmol·L-1NaCl 5 個(gè)梯度，每個(gè)鹽梯度下設(shè)置0（C0）、15（C1）、30（C2）mmol·L-1CaCl23 個(gè) 處 理， 共 計(jì)15 個(gè) 處理，每處理重復(fù)4 次，每重復(fù)30 株苗。以S0C0（0 mmol·L-1NaCl+ 0 mmol·L-1CaCl2） 為 對(duì) 照（CK），觀測(cè)15 個(gè)處理生長(zhǎng)生理指標(biāo)變化。各處理苗木均置于人工控制環(huán)境條件的生長(zhǎng)室進(jìn)行，光 照 強(qiáng) 度450 μmol·m-2·s-1、光 照12 h、溫 度28±0.5 ℃、相對(duì)濕度80 %，每周換1 次營(yíng)養(yǎng)液，每日早晚各充氣1 次，每次充30 min。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 當(dāng)幼苗脅迫處理4 周后，進(jìn)行生長(zhǎng)與生理指標(biāo)的測(cè)定。其中，依據(jù)15 個(gè)處理生長(zhǎng)指標(biāo)觀測(cè)結(jié)果，確定120 mmol·L-1NaCl（S3C0處理）為本試驗(yàn)供試木麻苗幼苗的鹽害閾值、25 mmol·L-1CaCl2為該鹽濃度處理下最佳鈣緩解濃度（S3C1 處理）。因此，以S3C0 和S3C1 處理為研究對(duì)象，進(jìn)一步分析木麻黃幼苗根系離子微區(qū)分布、葉片鈣離子亞細(xì)胞定位與質(zhì)膜透性的變化。

存活率：分別統(tǒng)計(jì)各處理存活苗木數(shù)量，根據(jù)存活株數(shù)占初始總株數(shù)百分比計(jì)算存活率。

鹽害率：以脅迫處理4 周后對(duì)照處理苗木存活率為參照，根據(jù)對(duì)照處理苗木存活率和各鹽處理苗木存活率的差與對(duì)照處理苗木存活率的比值計(jì)算鹽害率[21]，即：鹽害率（%）=（對(duì)照處理苗木存活率-鹽處理苗木存活率）/對(duì)照處理苗木存活率×100。

根系離子微區(qū)分布：截取植株根尖進(jìn)行橫切面的徒手切片，樣品直徑長(zhǎng)1 mm、厚0.3 mm。然后將樣品平鋪于貼有導(dǎo)電膠帶的銅板上，每處理放4 個(gè)樣品，自然晾干后噴鍍碳膜。于德國(guó)LEO 1530VP 型可變壓力場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察，用英國(guó)OXFORD INCA-300 型X-射線能譜儀分析，加速電壓20KV，樣品傾角0°。以Na+、Cl-、K+、Ca2+、Mg2+為分析離子收集譜線能譜圖。利用計(jì)算機(jī)附帶軟件，自動(dòng)判讀根部表皮、皮層和中柱各離子相對(duì)百分含量。

葉片Ca2+亞細(xì)胞化學(xué)定位：將葉片切成3 mm× 5 mm 大小后投入到2.5%（V/V）戊二醛加4%（V/V）多聚甲醛的混合固定液中，真空抽氣1 h 后置于25 ℃黑暗條件下固定6 h。用2%（m/m）焦銻酸鉀磷酸緩沖液（pH 7.6）清洗4 次后轉(zhuǎn)至1%鋨酸中固定10 h，清洗干凈后進(jìn)行系列梯度酒精脫水，梯度丙酮過(guò)渡，Epon812 樹(shù)脂滲透。然后Epon812 包埋過(guò)夜，35 ℃聚合12 h，45 ℃聚合12 h，60 ℃聚合48 h。最后采用超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并照相。對(duì)照切片的處理：將在電鏡下已確定有焦銻酸鈣沉淀的切片，漂浮在100 mmol/L 的EGTA（pH 8.0）溶液中，60 ℃處理0.5～l h，使EGTA 與Ca2+鰲合，脫去沉淀中的Ca2+再置于電鏡下觀察照相，如果原黑色沉淀區(qū)域表現(xiàn)出與其形狀相同的透明區(qū)域，則證明以切片中黑色沉淀作為Ca2+定位來(lái)反映的Ca2+分布區(qū)域是真實(shí)可信。

葉片質(zhì)膜透性指標(biāo)測(cè)定：相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法，膜脂過(guò)氧化物丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行測(cè)定[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理分析，運(yùn)用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，兩個(gè)處理間差異性檢驗(yàn)采取t-test（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源鈣對(duì)鹽脅迫下木麻黃幼苗生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)供試木麻黃幼苗表現(xiàn)出了較強(qiáng)的鹽敏感性，加之鹽處理時(shí)間僅為4 周，除對(duì)照外，各處理苗高、地徑、生物量等生長(zhǎng)指標(biāo)增量變化不明顯。鑒于此，為確定木麻黃幼苗的鹽害閾值，該試驗(yàn)選擇以幼苗存活率作為判斷不同鹽濃度處理下木麻黃遭受鹽害的生長(zhǎng)指標(biāo)。由表1 可知，不同鹽濃度處理木麻黃幼苗存活率差異顯著，其中在鹽濃度為0～80 mmol·L-1時(shí)，存活率約為90%～100%、鹽害率0%～10%，而濃度達(dá)到120 mmol·L-1時(shí)，存活率為49%、鹽害率51%，當(dāng)濃度增至160 mmol·L-1時(shí)，苗木基本已完全死亡，存活率僅為3%、鹽害率達(dá)97%。這說(shuō)明，120 mmol·L-1NaCl 可作為本試驗(yàn)供試木麻黃幼苗的鹽害閾值。從各鹽濃度處理下外源鈣的緩解效果來(lái)看，較低鹽濃度（0～120 mmol·L-1）范圍內(nèi)附加15 mmol·L-1CaC12時(shí)，幼苗存活率最高、鹽害率最小，而鹽濃度為160 mmol·L-1，則以30 mmol·L-1CaC12緩解效果最好，存活率增加975.4%、鹽害率降低28.4%，這反映了外源鈣能有效緩解木麻黃幼苗在鹽脅迫下遭受的損害程度。綜合各鹽處理的鈣緩解效果來(lái)看，以120 mmol·L-1鹽處理下15 mmol·L-1外源鈣（S3C1）的效果最好，存活率由48.6%提升至92.8%，鹽害率降低程度最大，下降了86.9%，僅為6.7%，與未加鈣120 mmol·L-1鹽處理（S3C0）相比差異尤為顯著。

表1 外源鈣對(duì)鹽脅迫下木麻黃幼苗存活率及鹽害率的影響Tab.1 Effects of exogenous calcium on survival rate and salt injury rate of Casuarina equisetifolia seedlings under salt stress

2.2 外源鈣對(duì)鹽脅迫下木麻黃幼苗生理參數(shù)的影響

2.2.1 根系離子微區(qū)分布的變化 為進(jìn)一步分析鹽脅迫下外源鈣的緩解作用機(jī)制，基于生長(zhǎng)指標(biāo)觀測(cè)結(jié)果，筆者重點(diǎn)分析了鈣緩解效果差異顯著的S3C0 和S3C1 處理下木麻黃幼苗生理參數(shù)的變化。植物遭受鹽害主要是通過(guò)影響根系對(duì)離子的選擇吸收。由圖1 可知，在S3C0 處理下根系表皮、皮層、中柱中Na+、Cl-相對(duì)含量為30.1%～61.3%，而K+、Ca2+、Mg2+僅 為1.1%～6.1%， 但 在S3C1處 理 下，Na+和Cl-分 別 降 至2.7%～5.0% 和20.0%～38.1%，K+、Ca2+、Mg2+分 別 增 至27.6%～38.8%、25.1%～30.8%和3.8%～8.1%。

圖1 S3C0 和S3C1 處理下木麻黃幼苗根系離子分布X-射線微區(qū)分析圖譜及相對(duì)含量Fig.1 X-ray microanalysis spectrum and relative content of root ion distribution in Casuarina equisetifolia seedlings under S3C1 and S3C0 treatments

從加鈣前后根系微區(qū)各離子相對(duì)含量變化幅度來(lái)看，加鈣后Na+、Cl-分別降低了89.6%和44.7%，而K+、Ca2+、Mg2+分別增加了2 048.7%、385.5%和279.8%（圖1）。這說(shuō)明，外源鈣對(duì)鹽離子毒害作用的緩解主要是通過(guò)影響Na+、K+、Ca2+、Mg2+間的平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。從表2 中Na+與K+、Ca2+、Mg2+離 子 比 例 在S3C0 和S3C1 處 理下的差異來(lái)看，S3C1 處理下表皮、皮層、中柱中K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+的比值均大于S3C0處理。從兩種處理下3 種離子比例大小來(lái)看，在未加鈣S3C0 處理下Ca2+/Na+＞ K+/Na+≈ Mg2+/Na+，在 加 鈣 的S3C1 處 理 下K+/Na+≈ Ca2+/Na+＞ Mg2+/Na+。該試驗(yàn)結(jié)果表明，外源鈣對(duì)鹽脅迫下K+、Ca2+的平衡調(diào)節(jié)作用大于Mg2+。

表2 S3C1 和S3C0 處理下木麻黃幼苗根系微區(qū)離子比Tab.2 Ion ratio in root micro-region of Casuarina equisetifolia seedlings under S3C0 and S3C1 treatments

2.2.2 葉片Ca2+亞細(xì)胞化學(xué)定位的變化 鈣離子作為第二信使，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育中的各種生理代謝過(guò)程。由圖2 中S3C0 和S3C1 兩種處理下幼苗葉片Ca2+亞細(xì)胞化學(xué)定位來(lái)看，在鈣抑制劑EGTA 作用下，并未觀察到明顯的Ca2+定位（圖2a），說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果是可靠。在S3C0 處理下除液泡膜上有少量Ca2+定位外（圖2b），未發(fā)現(xiàn)其他部位有明顯Ca2+定位，而在S3C1 處理下在液泡、質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)了大量Ca2+定位（圖2c）。這說(shuō)明，鹽脅迫下加鈣后引起木麻黃幼苗葉片膜系統(tǒng)中Ca2+增加。

圖2 S3C0 和S3C1 處理下木麻黃幼苗葉片Ca2+亞細(xì)胞化學(xué)定位Fig.2 Ca2+ cytochemical localization in leaves of Casuarina equisetifolia seedlings under S3C1 and S3C0 treatments

2.2.3 葉片質(zhì)膜透性的變化 葉片質(zhì)膜透性直接反映膜系統(tǒng)受損傷程度。從圖3 可以看出，與未加鈣S3C0 處理相比，在加鈣S3C1 處理下葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量顯著降低，分別較S3C0 處理降低了43.0%和23.8%。這說(shuō)明，加鈣后葉片質(zhì)膜透性減小，膜系統(tǒng)損害程度減輕。

圖3 S3C0 和S3C1 處理下木麻黃幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量變化Fig.3 Changes in relative conductivity and MDA content in leaves of Casuarina equisetifolia seedlings under S3C1 and S3C0 treatments

3 結(jié)論與討論

木麻黃由于其耐鹽抗旱能力強(qiáng)，在我國(guó)沿海地區(qū)被作為防護(hù)用材林樹(shù)種廣泛種植[5,9]。然而大量研究證明，早期木麻黃鹽敏感性較強(qiáng)，在鹽漬環(huán)境中易遭受損傷，從而抑制了植株生長(zhǎng)發(fā)育，造林成效不高[7-8]。從以往有關(guān)外源鈣對(duì)植物鹽害緩解研究報(bào)道來(lái)看，認(rèn)為外源鈣能有效減輕植株鹽害率[14]，這與本研究結(jié)果是相似的。筆者發(fā)現(xiàn)，供試木麻黃幼苗在鹽害閾值120 mmol·L-1NaCl 范圍內(nèi)，高濃度外源鈣30 mmol·L-1CaCl2降低了幼苗存活率、增加了植株鹽害率，而在160 mmol·L-1NaCl 處理下，施加30 mmol·L-1CaCl2反而增加了幼苗存活率、降低植株鹽害率。這表明，外源鈣能有效緩解木麻黃幼苗的鹽害程度，但具體使用濃度需依據(jù)鹽濃度進(jìn)行調(diào)整，具有“低鹽低鈣、高鹽高鈣”趨勢(shì)。

植物遭受的鹽害主要來(lái)源于單鹽離子，即Na+和Cl-毒害[23]。從施鈣前后木麻黃幼苗根系微區(qū)Na+、Cl-相對(duì)含量的變化來(lái)看，二者在施鈣后均有所下降，但Cl-仍保持在一個(gè)較高水平，尤其中柱中Cl-相對(duì)含量高達(dá)38.1%，說(shuō)明外源CaCl2使用未能有效對(duì)鹽脅迫下苗木根系中Cl-進(jìn)行區(qū)室化，Cl-損傷未得到明顯減輕，這可能也是在本試驗(yàn)中，除對(duì)照外各處理幼苗存活率雖得到大幅提升，但苗高、地徑、生物量增量不明顯的原因。Ca(NO3)2是生產(chǎn)中最為廣泛使用的一種鈣肥。但氮素作為植物生長(zhǎng)發(fā)育中的一種重要營(yíng)養(yǎng)元素，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提升抗逆性的作用。本試驗(yàn)為明確鈣對(duì)鹽脅迫的緩解效果，因此使用了CaCl2來(lái)代替Ca(NO3)2。考慮到Cl-毒害性，今后為進(jìn)一步提升外源鈣對(duì)木麻黃幼苗鹽害的緩解作用，建議可采用Ca(NO3)2作為沿海地區(qū)木麻黃幼林生長(zhǎng)期的鈣肥進(jìn)行施用，從而達(dá)到增強(qiáng)木麻黃耐鹽性，提高育林成效的目的。

研究證實(shí)，過(guò)量Na+導(dǎo)致植物體內(nèi)離子失衡，從而造成營(yíng)養(yǎng)元素虧缺，生理代謝活動(dòng)紊亂，細(xì)胞膜透性增加[24-25]。本試驗(yàn)通過(guò)分析120 mmol·L-1NaCl+0 mmol·L-1CaCl2（S3C0）和120 mmol·L-1NaCl+30 mmol·L-1CaCl2（S3C1）處 理下根系微區(qū)中Na+、K+、Ca2+、Mg2+相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下Na+大幅增加，K+、Ca2+、Mg2+減少，施鈣后Na+含量明顯下降，K+、Ca2+、Mg2+含量增加。從K+/Na+、Ca2+/Na+、Mg2+/Na+大小來(lái)看，K+/Na+、Ca2+/Na+明顯大于Mg2+/Na+。結(jié)合葉片Ca2+亞細(xì)胞定位和質(zhì)膜透性觀測(cè)結(jié)果可知，施鈣后膜系統(tǒng)上Ca2+定位明顯增多、膜透性減小，說(shuō)明鹽脅迫下施加外源鈣能有效增強(qiáng)膜系統(tǒng)完整性。K+具有與Na+相似的離子半徑與水合能，鹽脅迫會(huì)使植株體內(nèi)Na+富積，從而導(dǎo)致K+吸收困難，對(duì)生長(zhǎng)造成不利影響[26-27]。Ca2+在保持細(xì)胞膜完整性和穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[28]。維持穩(wěn)定的Ca2+水平，一方面能增加膜系統(tǒng)完整性，同時(shí)作為第二信使，能保持正常的生理功能，增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收[29-30]。筆者認(rèn)為，鹽脅迫下使用外源鈣能增強(qiáng)膜系統(tǒng)穩(wěn)定性，增強(qiáng)植株對(duì)K+吸收利用。這反映了，外源鈣對(duì)鹽脅迫下木麻黃幼苗鹽害緩解作用的核心機(jī)制一是保護(hù)膜系統(tǒng)完整性，二是調(diào)節(jié)K+平衡。因此推測(cè)，為有效提升木麻黃的耐鹽能力可適當(dāng)施用鈣鉀含量較高的混復(fù)肥，既能增強(qiáng)膜系統(tǒng)完整性，同時(shí)增加植株K+含量，促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育。